聚合物的阳性对照材料（17篇）聚合物的阳性对照材料 医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验1范围GB/T16886的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。这些方法规定了下面是小编为大家整理的聚合物的阳性对照材料（17篇）,供大家参考。
篇一：聚合物的阳性对照材料
医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验1范围GB/T16886的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵育；a）用器械的浸提液，和／或b）与器械接触。这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应.2规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T16886的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T16886。1医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验(GB/T16886.1—2001，idtISO10993—1:1997）CB/T16886。12-2000医疗器械生物学评价第12部分：样品制备和参照材料（idtISO1099312：1996）3术语与定义GB/T16886.1/ISO1993-1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。3。1阴性对照材料negativecontrolmaterial按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料.
注:阴性对照的目的是验证背景反应，例如高密度聚乙烯1）已作为合成聚合物的阴性对照材料,氧化陶瓷棒则用作牙科材料的阴性对照物。
3。2阳性对照材料positivecontrolmaterial
按照本部分试验时可重现细胞毒性反应的材料。
注:阳性对照的白目的是验证相应试验系统的反应,例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯2）已用作固体材料和浸提液的阳性对照，酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。
_____________________________________1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会（Rockvillie,Maryland,USA)和Hatano研究所食品和药品安全中心(Ochiai729—5,Hanagawa。257—Japan）获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便,但ISO对使用该产品不提供担保。2)有机锡聚氯乙烯阳性对照材料可从SIMSPortexLtd,Hythe，Kent，CT216JL，UK（产品号码499—300—000）获得.ZDEC和ZDBC聚氨甲酸乙酯可从Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5，Hanagawa257—Japan）获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。
3。3试剂对照reagentcontrol在不加试验材料的条件下，按浸提条件和试验步骤得到的浸提介质。
注：在本部分中,该定义取代GB/T16886。12/lSO10993—12中3.1给出的定义.
3。4培养器皿culturevessels适用于细胞培养的器皿，包插玻璃培养皿、塑料培养瓶或塑料多孔培养板和微量滴定板等器皿。
注，在这些试验方法中，这些器皿只要符合组织培养级别的要求，并适用于哺乳动物细胞培养．可以互换使用。
3。5近汇合subconfluency在对数生长期末,约80%的细胞汇合.
4样品制备4。1总则
供试品可选用:a)材料浸提液；和／或B）材料本身。
样品制备应符合CB/T16886。12/ISO10993—12。4。2材料浸提液的制备4.2.1浸提原则
为了测定潜在的毒理学危害,浸提条件应模拟或严于临床使用条件，但不应导致试验材料发生，诸如熔化、溶解或化学结构改变等明显变化。
注:浸提液中任何内源性或外源性物质的浓度及其接触试验细胞的量取决于接触面积、浸提体积、pH、化学溶解度、扩散率、溶质度、搅拌、温度、时间和其他因素。
4.2。2浸提介质哺乳动物细胞检测中应使用下列一种或几种溶剂。对浸提介质的选择应进行验证：a)含血清培养基;b)无血清培养基；c)生理盐水溶液；d）其他适宜的溶剂.
注：溶剂的选择应反映出浸提的目的,并应考虑使用极性和非极性两种溶剂。适宜的溶剂包括纯水、植物油、二甲基亚砜（DMSO）。在所选择的测试系统中．如DMSO浓度大于0。5％（体积分数），则有细胞毒性.
4.2.3浸提条件4.2.3.1浸提应使用无菌技术，在无菌、化学惰性的封闭容器中进行，应符合GB/T16886.12/lSO10993-12的基本要求。4.2。3.2推荐的浸提条件是:
a)37℃±2℃下不少于24h;b）50℃±2℃下72h±2h；c)70℃±2℃下24h±2h；d）121℃±2℃下1h士0.2h。可根据器械特性和具体使用情况选择推荐的条件。当浸提过程使用含血清培养基时,只能来用4.2.3.2a）规定的浸提条件。
4.2。3.3浸提液用于细胞之前,如果进行过滤、离心或其他处置方法，最终报告(见第9章）中应予以说明,对浸提液pH值的调整也应在提告中说明。对浸提撞的处理，例如对pH值的调整会影响试验结果。4.3直接接触试验材料的制备4。3.1在细胞毒性检测中,多种形状、尺寸或物理状态（即液态或固态)的材料未经修整即可进行测试。
固体样品应至少有一个平面。其他形状和物理状态的样品应进行调整。4。3。2应考虑试验样品的无菌性。4。3。2.1无菌器械试验材料的试验全过程应按无菌操作法进行。4。3.2.2试验材料如取自通常在使用前灭菌的器械，应按照制造商提供的方法灭菌，并且试验全过程应按无菌操作法进行。用于试验系统之前，制备试验材料时应考虑灭菌方法或灭菌剂对器械的影响.4。3。2。3试撞材料如取自使用中不需要灭菌的器械,则应在供应状态下使用，但在试验全过程中应按无菌操作法进行。4。3。3对液体进行试验应：a）直接附着；或b）附着到具有生物惰性和吸收性的基质上.
注：滤膜是适用的基质。
4。3.4对高吸收性材料，如果可能，试验前应用培养基将其浸透，以防吸收试验器皿中的培养基。5细胞系5。1优先采用已建立的细胞系并应从认可的贮源获取3）5。2在需要特殊敏感性时，只能使用直接由活体组织获取的原代细胞、细胞系和器官型培养物，但需证明其反应的重现性和准确性。5。3细胞系原种培养贮存时，应放在相应培养基内，在—80℃或-80℃以下冻存,培养基内加有细胞保护剂，如二甲基亚砜或甘油等，长期贮存（几月至几年）只能在-130℃或—130℃以下冻存.5。4试验应使用无支原体污染细胞，使用前采用可靠方法检测是否存在支原体污染。6培养基
6.1培养基应无菌。6.2含血清或无血清培养基应符合选定细胞系的生长要求。
注：培养基中允许含有对试验无不利影响的抗生素。培养基的稳定性与其成分和贮存条件有关。含谷氨酰胺和血清的培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过一周，含谷氨酰胺的无血清培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过2周。6.3培养基的pH值应为7.2～7。4.7细胞原种培养制备7。1用选定的细胞系和培养基制备试验所需足够的细胞。使用冻存细胞时，如加有细胞保护剂应除去，使用前至少传代培养一次。7.2取出细胞，用适宜的酶分散法和／或机械分散法制备成细胞悬浮液。———-—————--—--—
3)推荐的细胞系如CCL1（NCTCclone929)，CCL163(Balb/3T3cloneA31）、CCL171（MRC-5）、CCL75（Wl-38）、CCL81(Vero）、CCL10[BHK-21（C-l3）和V—79379A。这一信息只是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。也可使用其他能得出相同或更佳结果的细胞系。
8试验步骤8.1平行样数
至少采用三个平行试验样品数和对照数。8.2浸提液试验8.2。1该试验用于细胞毒性定性和定量评价。8.2。2从持续搅拌的细胞悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入浸提液接触的每只培养器皿内,轻轻转动培养器皿使细胞均匀地分散在器皿的表面。8.2。3根据培养基选择含或不含5％（体帜分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃士2℃温度下进行培养。
试验应在近汇合单层细胞或新鲜悬浮细胞上进行。如仅是检测克隆形成，应采用较低的细胞密度。8。2.4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。
8。2.5试验可选用:a)浸提原液；和b)以培养基作稀释剂的系列浸提稀释液。试验如果用单层细胞，应弃去培养器皿中的培养基，在每只器皿内加等量浸提液或上述稀释液。如用悬浮细胞进行试验,细胞悬浮液制备好后立即将浸提液或上述稀稀释液加到每只平行器皿中。
8。2.6采用水等非生理浸提液时,浸提液用培养基稀稀后应在最高生理相容浓度下试验。
注:建议在稀释浸提液时使用浓缩的（如2倍、5倍）培养基.
8。2.7加等量的空白试剂和阴性及阳性对照液至其他平行器血中.
注：如需要，还可以用新新鲜培养基做对照试验。
8.2。8器皿按8。2.3中所述同样条件进行培养，培养期间应符合选定方法的要求.8。2.9经过至少24h的培养后,接8。5确定细胞毒性反应.8.3直接接触试验8.3。1该试验用于细胞毒性定性和定量评价。8.3.2从持续搅拌的细胞悬液中吸取等量的悬浮液，注入与试验样品直接接触的每只器皿内。轻轻水平转动器皿，使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。8。3。3根据培养基选择含或不含5%（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养，直至培养细胞生长至近汇合。8。3.4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况.8。3.5弃去培养器皿中的培养基,加新鲜培养基至各器皿内。8.3.6在每只器皿中央部位的细胞层上各轻轻放置一个试验样品，应确保样品覆盖细胞层表面约十分之
操作时应注意防止样品不必耍的移动,否则可能会导致细胞的物理性损伤,这可从被移动细胞的碎片来判断。
注：如可能，在细胞加入前将样品放入培养器皿内。
8.3。7同法制备阴性和阳性对照材料平行器皿。8。3。8器皿按8。3.3中所述同样条件进行培养,培养期间（最少24h）应符合选定方法的要求.
8.3。9去除上层培养基,接8.5确定细胞毒性反应。8。4间接接触试验
8.4.1琼脂扩散试验
8.4。1。1该试验用于细胞毒性定性评价,该方法不适用于不能通过琼脂层扩散的可沥滤物或与琼脂反应的物质。
8.4。1。2从持续搅样的细跑悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入每只试验用平行器皿内。轻轻水平转动器皿．使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。
8.4.1.3根据培养基选择含或不含5％(体积分数)二氧化碳的空气作为缓冲系统,在37℃±2℃温度下进行培养，直至对数生长期末细胞近汇合。
8.4.1.4试验前用显微检查培养细胞的近汇合和形态情况。8。4.1。5弃去器皿中的培养基，然后将溶化琼脂与含血清的新鲜培养基混合，使琼脂最终质量浓度为0.5％~2％，每只器皿内加入等量的该混合液。只能使用适合于哺乳动物细胞生长的琼脂。该混合琼脂培养基应为液态,温度应适合于哺乳动物细胞。
注：各种不同分子量和纯度的琼脂可通用。
8.4.1。6将试验样品轻轻放在每只器血的固化琼脂层上，样品应覆盖细胞层表面约十分之一.吸水性材料置于琼脂之前先用培养基进行湿化处理，以防止琼脂脱水。
8.4。1。7同法制备阴性对照和阳性对照样品器皿。8。4。1.8按8.4.1.3中所述的同样条件培养24h～72h.8.4.1。9从琼脂上小心地取下样品之前、之后检测细胞毒性.。
用活体染色剂如中性红可有助于检测细胞毒性。活体染色剂可在培养前或培养后与样品一起加入．如在培养前加，应在避光条件下进行细胞培养，以防因染色剂光活化作用而引起细胞损伤。
8.4。2滤膜扩散试验8.4。2.1该试验用于细胞毒性定性评价.8.4。2。2在数只试验用培养皿内,各放置一枚孔径0.45μm、无表面活性剂的滤膜,并加入等量持续搅拌的细胞悬浮液，轻轻水平转动培养皿使细胞均匀地分散在每只滤膜的表面.8.4。2。3根据培养基选择含或不含5%（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统,在37℃±2℃温度下进行培养,直至对数生长期末细胞近汇合.
8。4。2.4试捡前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况.
8。4。2。5弃去培养皿内的培养基，将滤膜细胞面向下．放在固化的琼脂层上（见8。4.1.6)。
8。4.2。6轻经将试验样品放到滤膜无细胞面的上面．滤膜上放置不产生反应的环，用以保留提取液和新加入的成分.
8.4。2.7同法制备阴性和阳性对照样品滤膜。
8。4.2。8按8.4。2。3所述方法培养2h±10min。
8.4。2.9轻轻从滤膜上取下样品,并从琼脂面上小心分离开滤膜。
8。4。2。10采用合适的染色程序确定细胞毒性反应。
8.5细胞毒性判定
8.5。1可来用定性或定量方法检测细胞毒性。
a）定性评价：用显微镜检查细胞（如果需耍，使用细胞化学染色）评价诸如一般形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化，一般形态的改变可描述性地在试验报告中记录或以数字记录,以下是给试验材料计分的有效方法。
细胞需性计分
含义
0
无细胞毒性
1
轻微细胞毒性
2
中度细胞毒性
3
重度细胞毒性
试验报告中应包括评价方法和评价结果。
b）定量评价：测定细胞死亡、细胞生长抑制、细胞繁殖或细胞克隆形成.可以用客观的方法对细胞数量、蛋白总量、酶的释放、活体染料的释放和还原或其他可测定参数进行定量测试,使用的方法和测试结果应在试验报告中记录.
注：一些检测细胞毒性的特殊方法，可能需要零点或基线细胞培养对照。
8.5.2应慎重选择评价方法，试验样品如果释放对试验系统或对检测有影响的物质时，试验结果可能无效.
注：评价细胞活力，释放甲醛的材料须经过可靠的试验验证。
8。5.3各平行培养皿的检测结果如有显著差异,则判定试验不当或无效。
8。5。4阴性、阳性及任何其他对照物（参照、培养基、空白、试剂等）在试验系统中如无预期的反应，则应重新检测.9试验报告
试验报告应详细包括以下所有内容：a）样品的描述；b）细胞系并对选择进行论证；c)培养基;d）评价方法和原理；c）浸提步骤（如必要），如可能报告沥出物质的性质和浓度；f）阴性、阳性和其他对照物;g）细胞反应和其他情况;h)结果评价所需的其他有关资料.10结果评价应由合格的专业人员根据试验数据对试验结果进行总体评价.结果如没有说服力或者无效,应重做试验。
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篇二：聚合物的阳性对照材料
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999医疗器械生物学评价
第5部分:体外细胞毒性试验
1范围GB/T16886的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵育;a）用器械的浸提液，和／或b）与器械接触.这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应。
2规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T16886的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，
其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验（GB/T16886.1-2001,idtISO10993—1:1997)
CB/T16886.12—2000医疗器械生物学评价第12部分：样品制备和参照材料（idtISO10993—12：1996)
3术语与定义GB/T16886.1/ISO1993—1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。
3。1阴性对照材料negativecontrolmaterial
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。
注：阴性对照的目的是验证背景反应,例如高密度聚乙烯1）已作为合成聚合物的阴性对照材料，氧化陶瓷棒则用作牙科材料的阴性对照物.
3。2阳性对照材料positivecontrolmaterial按照本部分试验时可重现细胞毒性反应的材料。
注：阳性对照的白目的是验证相应试验系统的反应，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯2）已用作固体材料和浸提液的阳性对照，酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。
_____________________________________1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会（Rockvillie,Maryland,USA）和Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729—5，Hanagawa。257-Japan)获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便,但ISO对使用该产品不提供担保。2)有机锡聚氯乙烯阳性对照材料可从SIMSPortexLtd,Hythe,Kent，CT216JL，UK（产品号码499-300-000）获得。ZDEC和ZDBC聚氨甲酸乙酯可从Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5,Hanagawa257-Japan）获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便,但ISO对使用该产品不提供担保。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999
3)
3.3试剂对照reagentcontrol在不加试验材料的条件下,按浸提条件和试验步骤得到的浸提介质。
注：在本部分中，该定义取代GB/T16886。12/lSO10993—12中3。1给出的定义。
3.4培养器皿culturevessels适用于细胞培养的器皿，包插玻璃培养皿、塑料培养瓶或塑料多孔培养板和微量滴定板等器皿。
注，在这些试验方法中，这些器皿只要符合组织培养级别的要求,并适用于哺乳动物细胞培养．可以互换使用。
3。5近汇合subconfluency在对数生长期末,约80%的细胞汇合。
4样品制备4。1总则
供试品可选用：a）材料浸提液；和／或B）材料本身。样品制备应符合CB/T16886。12/ISO10993—12。4。2材料浸提液的制备4.2。1浸提原则为了测定潜在的毒理学危害，浸提条件应模拟或严于临床使用条件，但不应导致试验材料发生,诸如熔化、溶解或化学结构改变等明显变化.
注：浸提液中任何内源性或外源性物质的浓度及其接触试验细胞的量取决于接触面积、浸提体积、pH、化学溶解度、扩散率、溶质度、搅拌、温度、时间和其他因素。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：19994。2.2浸提介质
哺乳动物细胞检测中应使用下列一种或几种溶剂。对浸提介质的选择应进行验证：a)含血清培养基；b）无血清培养基;c)生理盐水溶液；d)其他适宜的溶剂。
注：溶剂的选择应反映出浸提的目的，并应考虑使用极性和非极性两种溶剂。适宜的溶剂包括纯水、植物油、二甲基亚砜（DMSO）。在所选择的测试系统中．如DMSO浓度大于0。5％（体积分数），则有细胞毒性。
4.2。3浸提条件4。2.3。1浸提应使用无菌技术，在无菌、化学惰性的封闭容器中进行，应符合GB/T16886。12/lSO10993-12的基本要求。4.2。3.2推荐的浸提条件是：
a）37℃±2℃下不少于24h；b）50℃±2℃下72h±2h；c）70℃±2℃下24h±2h；d）121℃±2℃下1h士0.2h。可根据器械特性和具体使用情况选择推荐的条件。当浸提过程使用含血清培养基时，只能来用4.2.3。2a）规定的浸提条件。4。2.3。3浸提液用于细胞之前,如果进行过滤、离心或其他处置方法,最终报告（见第9章）中应予以说明，对浸提液pH值的调整也应在提告中说明。对浸提撞的处理，例如对pH值的调整会影响试验结果。4.3直接接触试验材料的制备4.3。1在细胞毒性检测中,多种形状、尺寸或物理状态（即液态或固态）的材料未经修整即可进行测试。固体样品应至少有一个平面.其他形状和物理状态的样品应进行调整。4.3。2应考虑试验样品的无菌性。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：19994.3。2。1无菌器械试验材料的试验全过程应按无菌操作法进行。4。3。2。2试验材料如取自通常在使用前灭菌的器械，应按照制造商提供的方法灭菌，并且试验全过程应按无菌操作法进行.
用于试验系统之前，制备试验材料时应考虑灭菌方法或灭菌剂对器械的影响。4.3.2。3试撞材料如取自使用中不需要灭菌的器械，则应在供应状态下使用，但在试验全过程中应按无菌操作法进行。4.3.3对液体进行试验应：
a）直接附着；或b）附着到具有生物惰性和吸收性的基质上。
注:滤膜是适用的基质。
4.3。4对高吸收性材料，如果可能,试验前应用培养基将其浸透，以防吸收试验器皿中的培养基.
5细胞系5.1优先采用已建立的细胞系并应从认可的贮源获取3）5.2在需要特殊敏感性时，只能使用直接由活体组织获取的原代细胞、细胞系和器官型培养物，但需证明其反应的重现性和准确性。5。3细胞系原种培养贮存时，应放在相应培养基内，在-80℃或-80℃以下冻存，培养基内加有细胞保护剂，如二甲基亚砜或甘油等,长期贮存（几月至几年）只能在—130℃或—130℃以下冻存。5。4试验应使用无支原体污染细胞,使用前采用可靠方法检测是否存在支原体污染。
6培养基6.1培养基应无菌.6。2含血清或无血清培养基应符合选定细胞系的生长要求.
注：培养基中允许含有对试验无不利影响的抗生素。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999培养基的稳定性与其成分和贮存条件有关。含谷氨酰胺和血清的培养基在2℃～8℃条件下贮存不超
过一周,含谷氨酰胺的无血清培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过2周。6。3培养基的pH值应为7.2～7。4。7细胞原种培养制备
7。1用选定的细胞系和培养基制备试验所需足够的细胞。使用冻存细胞时，如加有细胞保护剂应除去，使用前至少传代培养一次。
7.2取出细胞，用适宜的酶分散法和／或机械分散法制备成细胞悬浮液。———————————————
3）推荐的细胞系如CCL1(NCTCclone929），CCL163（Balb/3T3cloneA31）、CCL171(MRC-5）、CCL75(Wl-38）、CCL81（Vero）、CCL10[BHK-21(C-l3）和V-79379A。这一信息只是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。也可使用其他能得出相同或更佳结果的细胞系。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999
8试验步骤8。1平行样数
至少采用三个平行试验样品数和对照数.8。2浸提液试验8。2。1该试验用于细胞毒性定性和定量评价。8。2.2从持续搅拌的细胞悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入浸提液接触的每只培养器皿内，轻轻转动培养器皿使细胞均匀地分散在器皿的表面.8.2.3根据培养基选择含或不含5%（体帜分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃士2℃温度下进行培养。
试验应在近汇合单层细胞或新鲜悬浮细胞上进行。如仅是检测克隆形成，应采用较低的细胞密度。8。2。4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况.8.2.5试验可选用：a）浸提原液；和b）以培养基作稀释剂的系列浸提稀释液。试验如果用单层细胞，应弃去培养器皿中的培养基，在每只器皿内加等量浸提液或上述稀释液.如用悬浮细胞进行试验，细胞悬浮液制备好后立即将浸提液或上述稀稀释液加到每只平行器皿中.8.2.6采用水等非生理浸提液时，浸提液用培养基稀稀后应在最高生理相容浓度下试验。
注:建议在稀释浸提液时使用浓缩的（如2倍、5倍）培养基。
8.2.7加等量的空白试剂和阴性及阳性对照液至其他平行器血中。
注：如需要，还可以用新新鲜培养基做对照试验。
8.2。8器皿按8。2。3中所述同样条件进行培养，培养期间应符合选定方法的要求。8。2.9经过至少24h的培养后,接8.5确定细胞毒性反应.8.3直接接触试验
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：19998.3。1该试验用于细胞毒性定性和定量评价。8。3。2从持续搅拌的细胞悬液中吸取等量的悬浮液，注入与试验样品直接接触的每只器皿内。轻轻水平转动器皿，使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。
8。3.3根据培养基选择含或不含5%(体积分数)二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养，直至培养细胞生长至近汇合.8。3.4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.3。5弃去培养器皿中的培养基，加新鲜培养基至各器皿内。8.3。6在每只器皿中央部位的细胞层上各轻轻放置一个试验样品，应确保样品覆盖细胞层表面约十分之
操作时应注意防止样品不必耍的移动，否则可能会导致细胞的物理性损伤，这可从被移动细胞的碎片来判断.
注：如可能，在细胞加入前将样品放入培养器皿内。
8。3。7同法制备阴性和阳性对照材料平行器皿。8。3。8器皿按8。3.3中所述同样条件进行培养，培养期间(最少24h）应符合选定方法的要求。8。3.9去除上层培养基,接8。5确定细胞毒性反应。8.4间接接触试验
8.4。1琼脂扩散试验
8。4。1.1该试验用于细胞毒性定性评价，该方法不适用于不能通过琼脂层扩散的可沥滤物或与琼脂反应的物质。
8.4。1.2从持续搅样的细跑悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入每只试验用平行器皿内。轻轻水平转动器皿．使细胞均匀地分散在每只器皿的表面.8.4.1。3根据培养基选择含或不含5%（体积分数)二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养，直至对数生长期末细胞近汇合。
8。4。1.4试验前用显微检查培养细胞的近汇合和形态情况.8.4。1.5弃去器皿中的培养基,然后将溶化琼脂与含血清的新鲜培养基混合，使琼脂最终质量浓度为0.5％～2％，每只器皿内加入等量的该混合液。只能使用适合于哺乳动物细胞生长的琼脂。该混合琼脂培养基应为液态，温度应适合于哺乳动物细胞。
注:各种不同分子量和纯度的琼脂可通用.
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：19998。4.1.6将试验样品轻轻放在每只器血的固化琼脂层上，样品应覆盖细胞层表面约十分之一.
吸水性材料置于琼脂之前先用培养基进行湿化处理，以防止琼脂脱水。8.4。1。7同法制备阴性对照和阳性对照样品器皿.8.4.1.8按8。4.1.3中所述的同样条件培养24h～72h.8。4。1。9从琼脂上小心地取下样品之前、之后检测细胞毒性.。
用活体染色剂如中性红可有助于检测细胞毒性。活体染色剂可在培养前或培养后与样品一起加入．如在培养前加，应在避光条件下进行细胞培养，以防因染色剂光活化作用而引起细胞损伤。8。4。2滤膜扩散试验8.4.2.1该试验用于细胞毒性定性评价。8。4.2.2在数只试验用培养皿内，各放置一枚孔径0。45μm、无表面活性剂的滤膜，并加入等量持续搅拌的细胞悬浮液，轻轻水平转动培养皿使细胞均匀地分散在每只滤膜的表面.8.4.2。3根据培养基选择含或不含5%(体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统,在37℃±2℃温度下进行培养，直至对数生长期末细胞近汇合。8。4.2.4试捡前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.4.2.5弃去培养皿内的培养基，将滤膜细胞面向下．放在固化的琼脂层上（见8。4。1。6）。8.4.2。6轻经将试验样品放到滤膜无细胞面的上面．滤膜上放置不产生反应的环，用以保留提取液和新加入的成分.8.4.2。7同法制备阴性和阳性对照样品滤膜.8.4.2。8按8。4。2。3所述方法培养2h±10min。8。4。2。9轻轻从滤膜上取下样品，并从琼脂面上小心分离开滤膜。8。4。2。10采用合适的染色程序确定细胞毒性反应。8.5细胞毒性判定8.5。1可来用定性或定量方法检测细胞毒性。
a）定性评价:用显微镜检查细胞（如果需耍，使用细胞化学染色）评价诸如一般形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化,一般形态的改变可描述性地在试验报告中记录或以数字记录,以下是给试验材料计分的有效方法。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999
细胞需性计分
含义
0
无细胞毒性
1
轻微细胞毒性
2
中度细胞毒性
3
重度细胞毒性
试验报告中应包括评价方法和评价结果。
b）定量评价：测定细胞死亡、细胞生长抑制、细胞繁殖或细胞克隆形成。可以用客观的方法对细胞数量、蛋白总量、酶的释放、活体染料的释放和还原或其他可测定参数进行定量测试，使用的方法和测试结果应在试验报告中记录。
注：一些检测细胞毒性的特殊方法，可能需要零点或基线细胞培养对照.
8.5。2应慎重选择评价方法，试验样品如果释放对试验系统或对检测有影响的物质时，试验结果可能无效。
注:评价细胞活力，释放甲醛的材料须经过可靠的试验验证。
8.5。3各平行培养皿的检测结果如有显著差异，则判定试验不当或无效.8.5.4阴性、阳性及任何其他对照物(参照、培养基、空白、试剂等）在试验系统中如无预期的反应,则应重新检测.
9试验报告
试验报告应详细包括以下所有内容：
a）样品的描述；
b)细胞系并对选择进行论证;
c）培养基;d）评价方法和原理；c)浸提步骤（如必要)，如可能报告沥出物质的性质和浓度；f）阴性、阳性和其他对照物;g）细胞反应和其他情况;
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999h)结果评价所需的其他有关资料。
10结果评价应由合格的专业人员根据试验数据对试验结果进行总体评价。结果如没有说服力或者无效，应重做
试验。-——---—--——-————-———
篇三：聚合物的阳性对照材料
医疗器械生物学评价
1范围
第5部分：体外细胞毒性试验
GB/T16886的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵育；
a)用器械的浸提液，和/或b)与器械接触。
这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过GB/T16886的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日
期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验(GB/T,idtISO109931:1997)
CB/T16886.12-2000医疗器械生物学评价第12部分：样品制备和参照材料(idtISO
1099312:1996)
3术语与定义
GB/T16886.1/ISO1993-1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。
阴性对照材料negativecontrolmaterial按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。注：阴性对照的目的是验证背景反应，例如高密度聚乙烯1已作为合成聚合物的阴性对照材料，氧化陶
瓷棒则用作牙科材料的阴性对照物。
阳性对照材料positivecontrolmaterial按照本部分试验时可重现细胞毒性反应的材料。注：阳性对照的白目的是验证相应试验系统的反应，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯2已用作固体材料和
浸提液的阳性对照，酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。
适用于细胞培养的器皿，包插玻璃培养皿、塑料培养瓶或塑料多孔培养板和微量滴定板等器皿。
注，在这些试验方法中，这些器皿只要符合组织培养级别的要求，并适用于哺乳动物细胞培养．可以互换使用。
近汇合subconfluency在对数生长期末，约80%的细胞汇合。
1高密度聚乙烯可从美国药典委员会(Rockvillie,Maryland,USA)和Hatano研究所食品和药品安全中心
(Ochiai729-5,)获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但
ISO对使用该产品不提供担保。
2有机锡聚氯乙烯阳性对照材料可从SIMSPortexLtd,Hythe,Kent,CT216JL,UK(产品号码499-300-000)获得。ZDEC
和ZDBC聚氨甲酸乙酯可从Hatano研究所食品和药品安全中心(Ochiai729-5,Hanagawa257-Japan)获得。提供这一信息
是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。
试剂对照reagentcontrol在不加试验材料的条件下，按浸提条件和试验步骤得到的浸提介质。
注：在本部分中，该定义取代GB/T16886.12/lSO10993-12
中给出的定义。
培养器皿culturevessels
4样品制备
总则供试品可选用：a）材料浸提液；和/或B）材料本身。
样品制备应符合CB/T16886.12/ISO10993-12。材料浸提液的制备
浸提原则
为了测定潜在的毒理学危害，浸提条件应模拟或严于临床使用条件，但不应导致试验材料发生，诸
如熔化、溶解或化学结构改变等明显变化。
注：浸提液中任何内源性或外源性物质的浓度及其接触试验细胞的量取决于接触面积、浸提体积、
pH化
学溶解度、扩散率、溶质度、搅拌、温度、时间和其他因素。
浸提介质哺乳动物细胞检测中应使用下列一种或几种溶剂。对浸提介质的选择应进行验证：
a）含血清培养基；
b）无血清培养基；
c）生理盐水溶液；
d）其他适宜的溶剂。
注：溶剂的选择应反映出浸提的目的，并应考虑使用极性和非极性两种溶剂。适宜的溶剂包括纯水、植物油、二甲基亚砜（DMSO。在所选择的测试系统中.如DMSC浓度大于%（体积分数），则有细胞毒性。
浸提条件lSO10993-12的基本要求。
a）37C±2C下不少于24h;
b）50C±2C下72h±2h;
c）70C±2C下24h±2h;
d）121C±2C下1h士0.2h。
可根据器械特性和具体使用情况选择推荐的条件。当浸提过程使用含血清培养基时，只能来用4.2.3.2a）规定的浸提条件。直接接触试验材料的制备在细胞毒性检测中，多种形状、尺寸或物理状态（即液态或固态）的材料未经修整即可进行测试。固体样品应至少有一个平面。其他形状和物理状态的样品应进行调整。应考虑试验样品的无菌性。用于试验系统之前，制备试验材料时应考虑灭菌方法或灭菌剂对器械的影响。对液体进行试验应：a）直接附着；或b）附着到具有生物惰性和吸收性的基质上。
注：滤膜是适用的基质。
对高吸收性材料，如果可能，试验前应用培养基将其浸透，以防吸收试验器皿中的培养基。
5细胞系优先采用已建立的细胞系并应从认可的贮源获取3
3推荐的细胞系如CCL1(NCTCclone929)，CCL163(Balb/3T3cloneA31)、CCL171(MRC-5)、CCL75(Wl-38八CCL81(Vero八CCL1O[BHK-21(C-I3)和V-79379A。这一信息只是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。也可使用其他能得出相同或更佳结果的细胞系。
8试验步骤
平行样数至少采用三个平行试验样品数和对照数。浸提液试验该试验用于细胞毒性定性和定量评价。
在需要特殊敏感性时，只能使用直接由活体组织获取的原代细胞、细胞系和器官型培养物，但需证
明其反应的重现性和准确性。
细胞系原种培养贮存时，应放在相应培养基内，在-80C或-80C以下冻存，培养基内加有细胞
篇四：聚合物的阳性对照材料
令狐采学创作
常见聚合物材料缩写对照表（中译名）
作者：岳占国
令狐采学英文简称英文全称中文全称ABAAcrylonitrile-butadiene-acrylate丙烯腈/丁二烯/丙烯酸酯共聚物ABSAcrylonitrile-butadiene-styrene丙烯腈/丁二烯/苯乙烯共聚物AESAcrylonitrile-ethylene-styrene丙烯腈/乙烯/苯乙烯共聚物AMMAAcrylonitrile/methylMethacrylate丙烯腈/甲基丙烯酸甲酯共聚物ARPAromaticpolyester聚芳香酯ASAcrylonitrile-styreneresin丙烯腈-苯乙烯树脂ASAAcrylonitrile-styrene-acrylate丙烯腈/苯乙烯/丙烯酸酯共聚物CACelluloseacetate醋酸纤维塑料CABCelluloseacetatebutyrate醋酸-丁酸纤维素塑料CAPCelluloseacetatepropionate醋酸-丙酸纤维素CE“Celluloseplastics,general”通用纤维素塑料CFCresol-formaldehyde甲酚-甲醛树脂CMCCarboxymethylcellulose羧甲基纤维素
令狐采学创作
令狐采学创作
CNCellulosenitrate硝酸纤维素CPCellulosepropionate丙酸纤维素CPEChlorinatedpolyethylene氯化聚乙烯CPVCChlorinatedpoly(vinylchloride)氯化聚氯乙烯CSCasein酪蛋白CTACellulosetriacetate三醋酸纤维素ECEthylcellulose乙烷纤维素EEAEthylene/ethylacrylate乙烯/丙烯酸乙酯共聚物EMAEthylene/methacrylicacid乙烯/甲基丙烯酸共聚物EP“Epoxy,epoxide”环氧树脂EPDEthylene-propylene-diene乙烯-丙烯-二烯三元共聚物EPMEthylene-propylenepolymer乙烯-丙烯共聚物EPSExpandedpolystyrene发泡聚苯乙烯ETFEEthylene-tetrafluoroethylene乙烯-四氟乙烯共聚物EVAEthylene/vinylacetate乙烯-醋酸乙烯共聚物EVALEthylene-vinylalcohol乙烯-乙烯醇共聚物FEPPerfluoro(ethylene-propylene)全氟（乙烯-丙烯）塑料FFFuranformaldehyde呋喃甲醛HDPEHigh-densitypolyethyleneplastics高密度聚乙烯塑料HIPSHighimpactpolystyrene高冲聚苯乙烯IPSImpact-resistantpolystyrene耐冲击聚苯乙烯LCPLiquidcrystalpolymer液晶聚合物LDPELow-densitypolyethyleneplastics低密度聚乙烯塑料
令狐采学创作
令狐采学创作
LLDPELinearlow-densitypolyethylene线性低密聚乙烯LMDPELinearmedium-densitypolyethylene线性中密聚乙烯MBSMethacrylate-butadiene-styrene甲基丙烯酸-丁二烯-苯乙烯共聚物MCMethylcellulose甲基纤维素MDPEMedium-densitypolyethylene中密聚乙烯MFMelamine-formaldehyderesin密胺-甲醛树脂MPFMelamine/phenol-formaldehyde密胺/酚醛树脂PAPolyamide(nylon)聚酰胺（尼龙）PAAPoly(acrylicacid)聚丙烯酸PADCPoly(allyldiglycolcarbonate)碳酸-二乙二醇酯·烯丙醇酯树脂PAEPolyarylether聚芳醚PAEKPolyaryletherketone聚芳醚酮PAIPolyamide-imide聚酰胺-酰亚胺PAKPolyesteralkyd聚酯树脂PANPolyacrylonitrile聚丙烯腈PARAPolyarylamide聚芳酰胺PASUPolyarylsulfone聚芳砜PATPolyarylate聚芳酯PAURPoly(esterurethane)聚酯型聚氨酯PBPolybutene-1聚丁烯-[1]PBAPoly(butylacrylate)聚丙烯酸丁酯
令狐采学创作
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PBANPolybutadiene-acrylonitrile聚丁二烯-丙烯腈PBSPolybutadiene-styrene聚丁二烯-苯乙烯PBTPoly(butyleneterephthalate)聚对苯二酸丁二酯PCPolycarbonate聚碳酸酯PCTFEPolychlorotrifluoroethylene聚氯三氟乙烯PDAPPoly(diallylphthalate)聚对苯二甲酸二烯丙酯PEPolyethylene聚乙烯PEBAPolyetherblockamide聚醚嵌段酰胺PEBAThermoplasticelastomerpolyether聚酯热塑弹性体PEEKPolyetheretherketone聚醚醚酮PEIPoly(etherimide)聚醚酰亚胺PEKPolyetherketone聚醚酮PEOPoly(ethyleneoxide)聚环氧乙烷PESPoly(ethersulfone)聚醚砜PETPoly(ethyleneterephthalate)聚对苯二甲酸乙二酯PETGPoly(ethyleneterephthalate)glycol二醇类改性PETPEURPoly(etherurethane)聚醚型聚氨酯PFPhenol-formaldehyderesin酚醛树脂PFAPerfluoro(alkoxyalkane)全氟烷氧基树脂PFFPhenol-furfuralresin酚呋喃树脂PIPolyimide聚酰亚胺PIBPolyisobutylene聚异丁烯PISUPolyimidesulfone聚酰亚胺砜
令狐采学创作
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PMCAPoly(methyl-alpha-chloroacrylate)聚α-氯代丙烯酸甲酯PMMAPoly(methylmethacrylate)聚甲基丙烯酸甲酯PMPPoly(4-methylpentene-1)聚4-甲基戊烯-1PMSPoly(alpha-methylstyrene)聚α-甲基苯乙烯POM“Polyoxymethylene,polyacetal”聚甲醛PPPolypropylene聚丙烯PPAPolyphthalamide聚邻苯二甲酰胺PPEPoly(phenyleneether)聚苯醚PPOPoly(phenyleneoxide)deprecated聚苯醚PPOXPoly(propyleneoxide)聚环氧（丙）烷PPSPoly(phenylenesulfide)聚苯硫醚PPSUPoly(phenylenesulfone)聚苯砜PSPolystyrene聚苯乙烯PSUPolysulfone聚砜PTFEPolytetrafluoroethylene聚四氟乙烯PURPolyurethane聚氨酯PVACPoly(vinylacetate)聚醋酸乙烯PVALPoly(vinylalcohol)聚乙烯醇PVBPoly(vinylbutyral)聚乙烯醇缩丁醛PVCPoly(vinylchloride)聚氯乙烯PVCAPoly(vinylchloride-acetate)聚氯乙烯醋酸乙烯酯PVCCchlorinatedpoly(vinylchloride)(*CPVC)氯化聚氯乙烯PVIpoly(vinylisobutylether)聚(乙烯基异丁基醚)PVMpoly(vinylchloridevinylmethylether)聚(氯乙烯-甲基乙
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烯基醚)
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RAMrestrictedareamolding窄面模塑
RFresorcinol-formaldehyderesin甲苯二酚-甲醛树脂
RIMreactioninjectionmolding反应注射模塑
RPreinforcedplastics增强塑料
RRIMreinforcedreactioninjectionmolding增强反应注射模塑
RTPreinforcedthermoplastics增强热塑性塑料
S/ANstyrene-acryonitrilecopolymer苯乙烯-丙烯腈共聚物
SBSstyrene-butadieneblockcopolymer苯乙烯-丁二烯嵌段共聚
物
SIsilicone聚硅氧烷
SMCsheetmoldingcompound片状模塑料
S/MSstyrene-α-methylstyrenecopolymer苯乙烯-α-甲基苯乙烯
共聚物
TMCthickmoldingcompound厚片模塑料
TPEthermoplasticelastomer热塑性弹性体
TPStoughenedpolystyrene韧性聚苯乙烯
TPUthermoplasticurethanes热塑性聚氨酯
TPXploymethylpentene聚-4-甲基-1戊烯
VG/Evinylchloride-ethylenecopolymer聚乙烯-乙烯共聚物
VC/E/MAvinylchloride-ethylene-methylacrylatecopolymer聚乙
烯-乙烯-丙烯酸甲酯共聚物
VC/E/VCAvinylchloride-ethylene-vinylacetatecopolymer氯乙烯
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-乙烯-醋酸乙烯酯共聚物PVDCPoly(vinylidenechloride)聚（偏二氯乙烯）PVDFPoly(vinylidenefluoride)聚（偏二氟乙烯）PVFPoly(vinylfluoride)聚氟乙烯PVFMPoly(vinylformal)聚乙烯醇缩甲醛PVKPolyvinylcarbazole聚乙烯咔唑PVPPolyvinylpyrrolidone聚乙烯吡咯烷酮S/MAStyrene-maleicanhydrideplastic苯乙烯-马来酐塑料SANStyrene-acrylonitrileplastic苯乙烯-丙烯腈塑料SBStyrene-butadieneplastic苯乙烯-丁二烯塑料SiSiliconeplastics有机硅塑料SMSStyrene/alpha-methylstyreneplastic苯乙烯-α-甲基苯乙烯塑料SPSaturatedpolyesterplastic饱和聚酯塑料SRPStyrene-rubberplastics聚苯乙烯橡胶改性塑料TEEE“ThermoplasticElastomer,Ether-Ester”醚酯型热塑弹性体TEO“ThermoplasticElastomer,Olefinic”聚烯烃热塑弹性体TES“ThermoplasticElastomer,Styrenic”苯乙烯热塑性弹性体TPELThermoplasticelastomer热塑(性)弹性体TPESThermoplasticpolyester热塑性聚酯TPURThermoplasticpolyurethane热塑性聚氨酯TSURThermosetpolyurethane热固聚氨酯
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UFUrea-formaldehyderesin脲甲醛树脂UHMWPEUltra-highmolecularweightPE超高分子量聚乙烯UPUnsaturatedpolyester不饱和聚酯VCEVinylchloride-ethyleneresin氯乙烯/乙烯树脂VCEVVinylchloride-ethylene-vinyl氯乙烯/乙烯/醋酸乙烯共聚物VCMAVinylchloride-methylacrylate氯乙烯/丙烯酸甲酯共聚物VCMMAVinylchloride-methylmethacrylate氯乙烯/甲基丙烯酸甲酯共聚物VCOAVinylchloride-octylacrylateresin氯乙烯/丙烯酸辛酯树脂VCVACVinylchloride-vinylacetateresin氯乙烯/醋酸乙烯树脂VCVDCVinylchloride-vinylidenechloride氯乙烯/偏氯乙烯共聚物
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篇五：聚合物的阳性对照材料
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第5部分：体外细胞毒性试验
1范围GB/T16886的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵育；a）用器械的浸提液，和／或b）与器械接触。这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应。
2规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T16886的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，
其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验（GB/T16886.1-2001,idtISO10993-1:1997）CB/T16886.12-2000医疗器械生物学评价第12部分：样品制备和参照材料（idtISO1099312:1996）
3术语与定义GB/T16886.1/ISO1993-1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。
3.1阴性对照材料negativecontrolmaterial按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。
只供学习与交流
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注：阴性对照的目的是验证背景反应，例如高密度聚乙烯1）已作为合成聚合物的阴性对照材料，氧化陶瓷棒则用作牙科材料的阴性对照物。
3.2阳性对照材料positivecontrolmaterial按照本部分试验时可重现细胞毒性反应的材料。
注：阳性对照的白目的是验证相应试验系统的反应，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯2）已用作固体材料和浸提液的阳性对照，酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。
_____________________________________1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会（Rockvillie,Maryland,USA）和Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5,Hanagawa.257-Japan）获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。2)有机锡聚氯乙烯阳性对照材料可从SIMSPortexLtd,Hythe,Kent,CT216JL,UK（产品号码499-300-000）获得。ZDEC和ZDBC聚氨甲酸乙酯可从Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5,Hanagawa257-Japan)获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。
只供学习与交流
此文档仅供收集于网络，如有侵权请联系网站删除3.3
试剂对照reagentcontrol在不加试验材料的条件下，按浸提条件和试验步骤得到的浸提介质。
注：在本部分中，该定义取代GB/T16886.12/lSO10993-12中3.1给出的定义。
3.4培养器皿culturevessels适用于细胞培养的器皿，包插玻璃培养皿、塑料培养瓶或塑料多孔培养板和微量滴定板等器皿。
注，在这些试验方法中，这些器皿只要符合组织培养级别的要求，并适用于哺乳动物细胞培养．可以互换使用。
3.5近汇合subconfluency在对数生长期末，约80%的细胞汇合。
4样品制备4.1总则
供试品可选用：a）材料浸提液；和／或B）材料本身。样品制备应符合CB/T16886.12/ISO10993-12。4.2材料浸提液的制备4.2.1浸提原则为了测定潜在的毒理学危害，浸提条件应模拟或严于临床使用条件，但不应导致试验材料发生，诸如熔化、溶解或化学结构改变等明显变化。
注：浸提液中任何内源性或外源性物质的浓度及其接触试验细胞的量取决于接触面积、浸提体积、pH、化学溶解度、扩散率、溶质度、搅拌、温度、时间和其他因素。
4.2.2浸提介质只供学习与交流
此文档仅供收集于网络，如有侵权请联系网站删除哺乳动物细胞检测中应使用下列一种或几种溶剂。对浸提介质的选择应进行验证：a)含血清培养基；b)无血清培养基；c)生理盐水溶液；d)其他适宜的溶剂。
注：溶剂的选择应反映出浸提的目的，并应考虑使用极性和非极性两种溶剂。适宜的溶剂包括纯水、植物油、二甲基亚砜（DMSO）。在所选择的测试系统中．如DMSO浓度大于0.5%（体积分数），则有细胞毒性。
4.2.3浸提条件4.2.3.1浸提应使用无菌技术，在无菌、化学惰性的封闭容器中进行，应符合GB/T16886.12/lSO10993-12的基本要求。4.2.3.2推荐的浸提条件是：
a)37℃±2℃下不少于24h；b)50℃±2℃下72h±2h；c)70℃±2℃下24h±2h；d)121℃±2℃下1h士0.2h。可根据器械特性和具体使用情况选择推荐的条件。当浸提过程使用含血清培养基时，只能来用4.2.3.2a）规定的浸提条件。4.2.3.3浸提液用于细胞之前，如果进行过滤、离心或其他处置方法，最终报告（见第9章）中应予以说明，对浸提液pH值的调整也应在提告中说明。对浸提撞的处理，例如对pH值的调整会影响试验结果。4.3直接接触试验材料的制备4.3.1在细胞毒性检测中，多种形状、尺寸或物理状态（即液态或固态）的材料未经修整即可进行测试。固体样品应至少有一个平面。其他形状和物理状态的样品应进行调整。4.3.2应考虑试验样品的无菌性。4.3.2.1无菌器械试验材料的试验全过程应按无菌操作法进行。只供学习与交流
此文档仅供收集于网络，如有侵权请联系网站删除4.3.2.2试验材料如取自通常在使用前灭菌的器械，应按照制造商提供的方法灭菌，并且试验全过程应按无菌操作法进行。
篇六：聚合物的阳性对照材料
WORD格式可编辑
医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验
1范围GB/T16886的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵育；a）用器械的浸提液，和／或b）与器械接触。这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应。
2规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T16886的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，
其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验（GB/T16886.1-2001,idtISO109931:1997）
CB/T16886.12-2000医疗器械生物学评价第12部分：样品制备和参照材料（idtISO1099312:1996）
3术语与定义GB/T16886.1/ISO1993-1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。
3.1阴性对照材料negativecontrolmaterial按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。
注：阴性对照的目的是验证背景反应，例如高密度聚乙烯1）已作为合成聚合物的阴性对照材料，氧化陶瓷棒则用作牙科材料的阴性对照物。
3.2阳性对照材料positivecontrolmaterial按照本部分试验时可重现细胞毒性反应的材料。
注：阳性对照的白目的是验证相应试验系统的反应，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯2）已用作固体材料和浸提液的阳性对照，酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。
_____________________________________1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会（Rockvillie,Maryland,USA）和Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5,Hanagawa.257-Japan）获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。2)有机锡聚氯乙烯阳性对照材料可从SIMSPortexLtd,Hythe,Kent,CT216JL,UK（产品号码499-300-000）获得。ZDEC和ZDBC聚氨甲酸乙酯可从Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5,Hanagawa257-Japan)获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。
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3.3试剂对照reagentcontrol在不加试验材料的条件下，按浸提条件和试验步骤得到的浸提介质。
注：在本部分中，该定义取代GB/T16886.12/lSO10993-12中3.1给出的定义。
3.4培养器皿culturevessels适用于细胞培养的器皿，包插玻璃培养皿、塑料培养瓶或塑料多孔培养板和微量滴定板等器皿。
注，在这些试验方法中，这些器皿只要符合组织培养级别的要求，并适用于哺乳动物细胞培养．可以互换使用。
3.5近汇合subconfluency在对数生长期末，约80%的细胞汇合。
4样品制备4.1总则
供试品可选用：a）材料浸提液；和／或B）材料本身。样品制备应符合CB/T16886.12/ISO10993-12。4.2材料浸提液的制备4.2.1浸提原则为了测定潜在的毒理学危害，浸提条件应模拟或严于临床使用条件，但不应导致试验材料发生，诸如熔化、溶解或化学结构改变等明显变化。
注：浸提液中任何内源性或外源性物质的浓度及其接触试验细胞的量取决于接触面积、浸提体积、pH、化学溶解度、扩散率、溶质度、搅拌、温度、时间和其他因素。
4.2.2浸提介质哺乳动物细胞检测中应使用下列一种或几种溶剂。对浸提介质的选择应进行验证：a)含血清培养基；b)无血清培养基；c)生理盐水溶液；d)其他适宜的溶剂。
注：溶剂的选择应反映出浸提的目的，并应考虑使用极性和非极性两种溶剂。适宜的溶剂包括纯水、植物油、二甲基亚砜（DMSO）。在所选择的测试系统中．如DMSO浓度大于0.5%（体积分数），则有细胞毒性。
4.2.3浸提条件4.2.3.1浸提应使用无菌技术，在无菌、化学惰性的封闭容器中进行，应符合GB/T16886.12/lSO10993-12的基本要求。4.2.3.2推荐的浸提条件是：
a)37℃±2℃下不少于24h；b)50℃±2℃下72h±2h；c)70℃±2℃下24h±2h；d)121℃±2℃下1h士0.2h。可根据器械特性和具体使用情况选择推荐的条件。当浸提过程使用含血清培养基时，只能来用4.2.3.2a）规定的浸提条件。
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4.2.3.3浸提液用于细胞之前，如果进行过滤、离心或其他处置方法，最终报告（见第9章）中应予以说明，对浸提液pH值的调整也应在提告中说明。对浸提撞的处理，例如对pH值的调整会影响试验结果。4.3直接接触试验材料的制备4.3.1在细胞毒性检测中，多种形状、尺寸或物理状态（即液态或固态）的材料未经修整即可进行测试。
固体样品应至少有一个平面。其他形状和物理状态的样品应进行调整。4.3.2应考虑试验样品的无菌性。4.3.2.1无菌器械试验材料的试验全过程应按无菌操作法进行。4.3.2.2试验材料如取自通常在使用前灭菌的器械，应按照制造商提供的方法灭菌，并且试验全过程应按无菌操作法进行。用于试验系统之前，制备试验材料时应考虑灭菌方法或灭菌剂对器械的影响。4.3.2.3试撞材料如取自使用中不需要灭菌的器械，则应在供应状态下使用，但在试验全过程中应按无菌操作法进行。4.3.3对液体进行试验应：a）直接附着；或b）附着到具有生物惰性和吸收性的基质上。
注：滤膜是适用的基质。
4.3.4对高吸收性材料，如果可能，试验前应用培养基将其浸透，以防吸收试验器皿中的培养基。
5细胞系5.1优先采用已建立的细胞系并应从认可的贮源获取3）5.2在需要特殊敏感性时，只能使用直接由活体组织获取的原代细胞、细胞系和器官型培养物，但需证明其反应的重现性和准确性。5.3细胞系原种培养贮存时，应放在相应培养基内，在-80℃或-80℃以下冻存，培养基内加有细胞保护剂，如二甲基亚砜或甘油等，长期贮存（几月至几年）只能在-130℃或-130℃以下冻存。5.4试验应使用无支原体污染细胞，使用前采用可靠方法检测是否存在支原体污染。
6培养基6.1培养基应无菌。6.2含血清或无血清培养基应符合选定细胞系的生长要求。
注：培养基中允许含有对试验无不利影响的抗生素。培养基的稳定性与其成分和贮存条件有关。含谷氨酰胺和血清的培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过一周，含谷氨酰胺的无血清培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过2周。6.3培养基的pH值应为7.2～7.4。7细胞原种培养制备7.1用选定的细胞系和培养基制备试验所需足够的细胞。使用冻存细胞时，如加有细胞保护剂应除去，使用前至少传代培养一次。7.2取出细胞，用适宜的酶分散法和／或机械分散法制备成细胞悬浮液。———————————————
3）推荐的细胞系如CCL1（NCTCclone929），CCL163（Balb/3T3cloneA31）、CCL171（MRC-5）、CCL75（Wl-38）、CCL81（Vero）、CCL10[BHK-21(C-l3)和V-79379A。这一信息只是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。也可使用其他能得出相同或更佳结果的细胞系。
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8试验步骤8.1平行样数
至少采用三个平行试验样品数和对照数。8.2浸提液试验8.2.1该试验用于细胞毒性定性和定量评价。8.2.2从持续搅拌的细胞悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入浸提液接触的每只培养器皿内，轻轻转动培养器皿使细胞均匀地分散在器皿的表面。8.2.3根据培养基选择含或不含5%（体帜分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃士2℃温度下进行培养。
试验应在近汇合单层细胞或新鲜悬浮细胞上进行。如仅是检测克隆形成，应采用较低的细胞密度。8.2.4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.2.5试验可选用：a)浸提原液；和b)以培养基作稀释剂的系列浸提稀释液。试验如果用单层细胞，应弃去培养器皿中的培养基，在每只器皿内加等量浸提液或上述稀释液。如用悬浮细胞进行试验，细胞悬浮液制备好后立即将浸提液或上述稀稀释液加到每只平行器皿中。8.2.6采用水等非生理浸提液时，浸提液用培养基稀稀后应在最高生理相容浓度下试验。
注：建议在稀释浸提液时使用浓缩的（如2倍、5倍）培养基。
8.2.7加等量的空白试剂和阴性及阳性对照液至其他平行器血中。
注：如需要，还可以用新新鲜培养基做对照试验。
8.2.8器皿按8.2.3中所述同样条件进行培养，培养期间应符合选定方法的要求。8.2.9经过至少24h的培养后，接8.5确定细胞毒性反应。8.3直接接触试验8.3.1该试验用于细胞毒性定性和定量评价。8.3.2从持续搅拌的细胞悬液中吸取等量的悬浮液，注入与试验样品直接接触的每只器皿内。轻轻水平转动器皿，使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。8.3.3根据培养基选择含或不含5%（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养，直至培养细胞生长至近汇合。8.3.4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.3.5弃去培养器皿中的培养基，加新鲜培养基至各器皿内。8.3.6在每只器皿中央部位的细胞层上各轻轻放置一个试验样品，应确保样品覆盖细胞层表面约十分之
操作时应注意防止样品不必耍的移动，否则可能会导致细胞的物理性损伤，这可从被移动细胞的碎片来判断。
注：如可能，在细胞加入前将样品放入培养器皿内。
8.3.7同法制备阴性和阳性对照材料平行器皿。8.3.8器皿按8.3.3中所述同样条件进行培养，培养期间（最少24h）应符合选定方法的要求。8.3.9去除上层培养基，接8.5确定细胞毒性反应。8.4间接接触试验8.4.1琼脂扩散试验8.4.1.1该试验用于细胞毒性定性评价，该方法不适用于不能通过琼脂层扩散的可沥滤物或与琼脂反应的物质。
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8.4.1.2从持续搅样的细跑悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入每只试验用平行器皿内。轻轻水平转动器
皿．使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。
8.4.1.3根据培养基选择含或不含5%（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进
行培养，直至对数生长期末细胞近汇合。
8.4.1.4试验前用显微检查培养细胞的近汇合和形态情况。
8.4.1.5弃去器皿中的培养基，然后将溶化琼脂与含血清的新鲜培养基混合，使琼脂最终质量浓度为
0.5%～2%，每只器皿内加入等量的该混合液。只能使用适合于哺乳动物细胞生长的琼脂。该混合琼脂培
养基应为液态，温度应适合于哺乳动物细胞。
注：各种不同分子量和纯度的琼脂可通用。
8.4.1.6将试验样品轻轻放在每只器血的固化琼脂层上，样品应覆盖细胞层表面约十分之一。
吸水性材料置于琼脂之前先用培养基进行湿化处理，以防止琼脂脱水。
8.4.1.7同法制备阴性对照和阳性对照样品器皿。
8.4.1.8按8.4.1.3中所述的同样条件培养24h~72h.
8.4.1.9从琼脂上小心地取下样品之前、之后检测细胞毒性.。
用活体染色剂如中性红可有助于检测细胞毒性。活体染色剂可在培养前或培养后与样品一起加入．如
在培养前加，应在避光条件下进行细胞培养，以防因染色剂光活化作用而引起细胞损伤。
8.4.2滤膜扩散试验
8.4.2.1该试验用于细胞毒性定性评价。
8.4.2.2在数只试验用培养皿内，各放置一枚孔径0.45μm、无表面活性剂的滤膜，并加入等量持续搅
拌的细胞悬浮液，轻轻水平转动培养皿使细胞均匀地分散在每只滤膜的表面。
8.4.2.3根据培养基选择含或不含5%（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进
行培养，直至对数生长期末细胞近汇合。
8.4.2.4试捡前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。
8.4.2.5弃去培养皿内的培养基，将滤膜细胞面向下．放在固化的琼脂层上（见8.4.1.6）。
8.4.2.6轻经将试验样品放到滤膜无细胞面的上面．滤膜上放置不产生反应的环，用以保留提取液和新
加入的成分。
8.4.2.7同法制备阴性和阳性对照样品滤膜。
8.4.2.8按8.4.2.3所述方法培养2h±10min。
8.4.2.9轻轻从滤膜上取下样品，并从琼脂面上小心分离开滤膜。
8.4.2.10采用合适的染色程序确定细胞毒性反应。
8.5细胞毒性判定
8.5.1可来用定性或定量方法检测细胞毒性。
a）定性评价：用显微镜检查细胞（如果需耍，使用细胞化学染色）评价诸如一般形态、空泡形成、
脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化，一般形态的改变可描述性地在试验报告中记录或以数字记录，
以下是给试验材料计分的有效方法。
细胞需性计分
含义
0
无细胞毒性
1
轻微细胞毒性
2
中度细胞毒性
3
重度细胞毒性
试验报告中应包括评价方法和评价结果。
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b）定量评价：测定细胞死亡、细胞生长抑制、细胞繁殖或细胞克隆形成。可以用客观的方法对细胞数量、蛋白总量、酶的释放、活体染料的释放和还原或其他可测定参数进行定量测试，使用的方法和测试结果应在试验报告中记录。
注：一些检测细胞毒性的特殊方法，可能需要零点或基线细胞培养对照。
8.5.2应慎重选择评价方法，试验样品如果释放对试验系统或对检测有影响的物质时，试验结果可能无效。
注：评价细胞活力，释放甲醛的材料须经过可靠的试验验证。
8.5.3各平行培养皿的检测结果如有显著差异，则判定试验不当或无效。8.5.4阴性、阳性及任何其他对照物（参照、培养基、空白、试剂等）在试验系统中如无预期的反应，则应重新检测。9试验报告
试验报告应详细包括以下所有内容：a）样品的描述；b）细胞系并对选择进行论证；c）培养基；d）评价方法和原理；c）浸提步骤（如必要），如可能报告沥出物质的性质和浓度；f）阴性、阳性和其他对照物；g）细胞反应和其他情况；h）结果评价所需的其他有关资料。10结果评价应由合格的专业人员根据试验数据对试验结果进行总体评价。结果如没有说服力或者无效，应重做试验。
————————————————————
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篇七：聚合物的阳性对照材料
精心整理
医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验
1范围GB/T16886的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵
育；a）用器械的浸提液，和／或
b）与器械接触。这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应。
2规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T16886的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新
版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验（GB/T16886.1-2001,idtISO10993-1:1997）
CB/T16886.12-2000医疗器械生物学评价第12部分：样品制备和参照材料（idtISO1099312:1996）
精心整理3术语与定义
GB/T16886.1/ISO1993-1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。
3.1
阴性对照材料negativecontrolmaterial
按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。
注：阴性对照的目的是验证背景反应，例如高密度聚乙烯1）已作为合成聚合物的阴性对照材料，氧化陶瓷棒则用作牙科材料的阴性对照物。
3.2
阳性对照材料positivecontrolmaterial
按照本部分试验时可重现细胞毒性反应的材料。
注：阳性对照的白目的是验证相应试验系统的反应，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯2）已用作固体材料和浸提液的阳性对照，酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。
_____________________________________1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会（Rockvillie,Maryland,USA）和Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5,Hanagawa.257-Japan）获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。2)有机锡聚氯乙烯阳性对照材料可从SIMSPortexLtd,Hythe,Kent,CT216JL,UK（产品号码499-300-000）获得。ZDEC和ZDBC聚氨甲酸乙酯可从Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5,Hanagawa257-Japan)获得。提供这一信息是为本部分的使用
者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。
3.3试剂对照reagentcontrol在不加试验材料的条件下，按浸提条件和试验步骤得到的浸提介质。
注：在本部分中，该定义取代GB/T16886.12/lSO10993-12中3.1给出的定义。
3.4培养器皿culturevessels
精心整理
适用于细胞培养的器皿，包插玻璃培养皿、塑料培养瓶或塑料多孔培养板和微量滴定板等器皿。
注，在这些试验方法中，这些器皿只要符合组织培养级别的要求，并适用于哺乳动物细胞培养．可以互换使用。
3.5近汇合subconfluency在对数生长期末，约80%的细胞汇合。
4样品制备4.1总则供试品可选用：a）材料浸提液；和／或B）材料本身。样品制备应符合CB/T16886.12/ISO10993-12。4.2材料浸提液的制备4.2.1浸提原则为了测定潜在的毒理学危害，浸提条件应模拟或严于临床使用条件，但不应导致试验材料发生，诸如熔化、溶解或化学结构改变等明显变化。
注：浸提液中任何内源性或外源性物质的浓度及其接触试验细胞的量取决于接触面积、浸提体积、pH、化学溶解度、扩散率、溶质度、搅拌、温度、时间和其他因素。
4.2.2浸提介质哺乳动物细胞检测中应使用下列一种或几种溶剂。对浸提介质的选择应进行验证：
a)含血清培养基；b)无血清培养基；c)生理盐水溶液；d)其他适宜的溶剂。
注：溶剂的选择应反映出浸提的目的，并应考虑使用极性和非极性两种溶剂。适宜的溶剂包括纯水、植物油、二甲基亚砜（DMSO）。在所选择的测试系统中．如DMSO浓度大于0.5%（体积分数），则有细胞毒性。
4.2.3浸提条件lSO10993-12的基本要求。
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a)37℃±2℃下不少于24h；b)50℃±2℃下72h±2h；c)70℃±2℃下24h±2h；d)121℃±2℃下1h士0.2h。可根据器械特性和具体使用情况选择推荐的条件。当浸提过程使用含血清培养基时，只能来用4.2.3.2a）规定的浸提条件。4.3直接接触试验材料的制备4.3.1在细胞毒性检测中，多种形状、尺寸或物理状态（即液态或固态）的材料未经修整即可进行测试。固体样
品应至少有一个平面。其他形状和物理状态的样品应进行调整。
4.3.2应考虑试验样品的无菌性。用于试验系统之前，制备试验材料时应考虑灭菌方法或灭菌剂对器械的影响。
4.3.3对液体进行试验应：a）直接附着；或
b）附着到具有生物惰性和吸收性的基质上。
注：滤膜是适用的基质。
4.3.4对高吸收性材料，如果可能，试验前应用培养基将其浸透，以防吸收试验器皿中的培养基。5细胞系
5.1优先采用已建立的细胞系并应从认可的贮源获取3）5.2在需要特殊敏感性时，只能使用直接由活体组织获取的原代细胞、细胞系和器官型培养物，但需证
明其反应的重现性和准确性。5.3细胞系原种培养贮存时，应放在相应培养基内，在-80℃或-80℃以下冻存，培养基内加有细胞保护剂，如二
甲基亚砜或甘油等，长期贮存（几月至几年）只能在-130℃或-130℃以下冻存。5.4试验应使用无支原体污染细胞，使用前采用可靠方法检测是否存在支原体污染。
6培养基6.1培养基应无菌。6.2含血清或无血清培养基应符合选定细胞系的生长要求。
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注：培养基中允许含有对试验无不利影响的抗生素。培养基的稳定性与其成分和贮存条件有关。含谷氨酰胺和血清的培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过一周，
含谷氨酰胺的无血清培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过2周。6.3培养基的pH值应为7.2～7.4。7细胞原种培养制备
7.1用选定的细胞系和培养基制备试验所需足够的细胞。使用冻存细胞时，如加有细胞保护剂应除去，使用前至少传代培养一次。
7.2取出细胞，用适宜的酶分散法和／或机械分散法制备成细胞悬浮液。———————————————
3）推荐的细胞系如CCL1（NCTCclone929），CCL163（Balb/3T3cloneA31）、CCL171（MRC-5）、CCL75（Wl-38）、CCL81（Vero）、CCL10[BHK-21(C-l3)和V-79379A。这一信息只是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。也
可使用其他能得出相同或更佳结果的细胞系。
8试验步骤8.1平行样数至少采用三个平行试验样品数和对照数。8.2浸提液试验8.2.1该试验用于细胞毒性定性和定量评价。8.2.2从持续搅拌的细胞悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入浸提液接触的每只培养器皿内，轻轻转动培养器皿使细胞均匀地分散在器皿的表面。8.2.3根据培养基选择含或不含5%（体帜分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃士2℃温度下进行培养。试验应在近汇合单层细胞或新鲜悬浮细胞上进行。如仅是检测克隆形成，应采用较低的细胞密度。8.2.4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.2.5试验可选用：a)浸提原液；和b)以培养基作稀释剂的系列浸提稀释液。试验如果用单层细胞，应弃去培养器皿中的培养基，在每只器皿内加等量浸提液或上述稀释液。如用悬浮细胞进行试验，细胞悬浮液制备好后立即将浸提液或上述稀稀释液加到每只平行器皿中。
精心整理
8.2.6采用水等非生理浸提液时，浸提液用培养基稀稀后应在最高生理相容浓度下试验。
注：建议在稀释浸提液时使用浓缩的（如2倍、5倍）培养基。
8.2.7加等量的空白试剂和阴性及阳性对照液至其他平行器血中。
注：如需要，还可以用新新鲜培养基做对照试验。
8.2.8器皿按8.2.3中所述同样条件进行培养，培养期间应符合选定方法的要求。8.2.9经过至少24h的培养后，接8.5确定细胞毒性反应。8.3直接接触试验8.3.1该试验用于细胞毒性定性和定量评价。
8.3.2从持续搅拌的细胞悬液中吸取等量的悬浮液，注入与试验样品直接接触的每只器皿内。轻轻水平转动器皿，使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。
8.3.3根据培养基选择含或不含5%（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养，直至培养细胞生长至近汇合。
8.3.4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.3.5弃去培养器皿中的培养基，加新鲜培养基至各器皿内。8.3.6在每只器皿中央部位的细胞层上各轻轻放置一个试验样品，应确保样品覆盖细胞层表面约十分之操作时应注意防止样品不必耍的移动，否则可能会导致细胞的物理性损伤，这可从被移动细胞的碎片来判
断。
注：如可能，在细胞加入前将样品放入培养器皿内。
8.3.7同法制备阴性和阳性对照材料平行器皿。8.3.9去除上层培养基，接8.5确定细胞毒性反应。
8.4间接接触试验8.4.1琼脂扩散试验
注：各种不同分子量和纯度的琼脂可通用。
吸水性材料置于琼脂之前先用培养基进行湿化处理，以防止琼脂脱水。用活体染色剂如中性红可有助于检测细胞毒性。活体染色剂可在培养前或培养后与样品一起加入．如在培
养前加，应在避光条件下进行细胞培养，以防因染色剂光活化作用而引起细胞损伤。8.4.2滤膜扩散试验
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μm、无表面活性剂的滤膜，并加入等量持续搅拌的细胞悬浮液，轻轻水平转动培养皿使细胞均匀地分散在每只滤膜的表面。
8.5细胞毒性判定8.5.1可来用定性或定量方法检测细胞毒性。a）定性评价：用显微镜检查细胞（如果需耍，使用细胞化学染色）评价诸如一般形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化，一般形态的改变可描述性地在试验报告中记录或以数字记录，以下是给试
验材料计分的有效方法。细胞需性计分含义0无细胞毒性1轻微细胞毒性2中度细胞毒性3重度细胞毒性
试验报告中应包括评价方法和评价结果。b）定量评价：测定细胞死亡、细胞生长抑制、细胞繁殖或细胞克隆形成。可以用客观的方法对细胞数量、蛋白总量、酶的释放、活体染料的释放和还原或其他可测定参数进行定量测试，使用的方法和测试结果应在试
验报告中记录。
注：一些检测细胞毒性的特殊方法，可能需要零点或基线细胞培养对照。
8.5.2应慎重选择评价方法，试验样品如果释放对试验系统或对检测有影响的物质时，试验结果可能无效。
注：评价细胞活力，释放甲醛的材料须经过可靠的试验验证。
8.5.3各平行培养皿的检测结果如有显着差异，则判定试验不当或无效。8.5.4阴性、阳性及任何其他对照物（参照、培养基、空白、试剂等）在试验系统中如无预期的反应，则应重新
检测。9试验报告试验报告应详细包括以下所有内容：a）样品的描述；b）细胞系并对选择进行论证；
c）培养基；d）评价方法和原理；
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c）浸提步骤（如必要），如可能报告沥出物质的性质和浓度；f）阴性、阳性和其他对照物；g）细胞反应和其他情况；
h）结果评价所需的其他有关资料。10结果评价
应由合格的专业人员根据试验数据对试验结果进行总体评价。结果如没有说服力或者无效，应重做试验。————————————————————
篇八：聚合物的阳性对照材料
医
疗
器
械
生
物
学
评
价
第5部分：体外细胞毒性试验1范围
GB/T16886的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵育；a）用器械的浸提液，和／或b）与器械接触。这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应。2规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T16886的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验（GB/T,idtISO10993-1:1997）CB/T16886.12-2000医疗器械生物学评价第12部分：样品制备和参照材料（idtISO1099312:1996）3术语与定义GB/T16886.1/ISO1993-1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。
阴性对照材料negativecontrolmaterial按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。注：阴性对照的目的是验证背景反应，例如高密度聚乙烯1）已作为合成聚合物的阴性对照材料，氧化陶瓷棒则用
作牙科材料的阴性对照物。
阳性对照材料positivecontrolmaterial按照本部分试验时可重现细胞毒性反应的材料。注：阳性对照的白目的是验证相应试验系统的反应，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯2）已用作固体材料和浸提
液的阳性对照，酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。_____________________________________1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会（Rockvillie,Maryland,USA）和Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5,）获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。2)有机锡聚氯乙烯阳性对照材料可从SIMSPortexLtd,Hythe,Kent,CT216JL,UK（产品号码499-300-000）获得。ZDEC和ZDBC聚氨甲酸乙酯可从Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5,Hanagawa257-Japan)获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。
试剂对照reagentcontrol在不加试验材料的条件下，按浸提条件和试验步骤得到的浸提介质。
注：在本部分中，该定义取代GB/T16886.12/lSO10993-12中给出的定义。
培养器皿culturevessels适用于细胞培养的器皿，包插玻璃培养皿、塑料培养瓶或塑料多孔培养板和微量滴定板等器皿。
注，在这些试验方法中，这些器皿只要符合组织培养级别的要求，并适用于哺乳动物细胞培养．可以互换使用。
近汇合subconfluency在对数生长期末，约80%的细胞汇合。
4样品制备总则供试品可选用：a）材料浸提液；和／或B）材料本身。样品制备应符合CB/T16886.12/ISO10993-12。材料浸提液的制备浸提原则为了测定潜在的毒理学危害，浸提条件应模拟或严于临床使用条件，但不应导致试验材料发生，
诸如熔化、溶解或化学结构改变等明显变化。
注：浸提液中任何内源性或外源性物质的浓度及其接触试验细胞的量取决于接触面积、浸提体积、pH、化学溶解度、扩散率、溶质度、搅拌、温度、时间和其他因素。
浸提介质哺乳动物细胞检测中应使用下列一种或几种溶剂。对浸提介质的选择应进行验证：a)含血清培养基；b)无血清培养基；c)生理盐水溶液；d)其他适宜的溶剂。
注：溶剂的选择应反映出浸提的目的，并应考虑使用极性和非极性两种溶剂。适宜的溶剂包括纯水、植物油、二
甲基亚砜（DMSO）。在所选择的测试系统中．如DMSO浓度大于%（体积分数），则有细胞毒性。
浸提条件lSO10993-12的基本要求。
a)37℃±2℃下不少于24h；b)50℃±2℃下72h±2h；c)70℃±2℃下24h±2h；d)121℃±2℃下1h士0.2h。可根据器械特性和具体使用情况选择推荐的条件。当浸提过程使用含血清培养基时，只能来用4.2.3.2a）规定的浸提条件。直接接触试验材料的制备在细胞毒性检测中，多种形状、尺寸或物理状态（即液态或固态）的材料未经修整即可进行测试。固体样品应至少有一个平面。其他形状和物理状态的样品应进行调整。应考虑试验样品的无菌性。用于试验系统之前，制备试验材料时应考虑灭菌方法或灭菌剂对器械的影响。对液体进行试验应：a）直接附着；或b）附着到具有生物惰性和吸收性的基质上。
注：滤膜是适用的基质。
对高吸收性材料，如果可能，试验前应用培养基将其浸透，以防吸收试验器皿中的培养基。5细胞系
优先采用已建立的细胞系并应从认可的贮源获取3）在需要特殊敏感性时，只能使用直接由活体组织获取的原代细胞、细胞系和器官型培养物，但需证明其反应的重现性和准确性。细胞系原种培养贮存时，应放在相应培养基内，在-80℃或-80℃以下冻存，培养基内加有细胞保护剂，如二甲基亚砜或甘油等，长期贮存（几月至几年）只能在-130℃或-130℃以下冻存。试验应使用无支原体污染细胞，使用前采用可靠方法检测是否存在支原体污染。
6培养基培养基应无菌。含血清或无血清培养基应符合选定细胞系的生长要求。注：培养基中允许含有对试验无不利影响的抗生素。培养基的稳定性与其成分和贮存条件有关。含谷氨酰胺和血清的培养基在2℃～8℃条件下贮存不
超过一周，含谷氨酰胺的无血清培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过2周。培养基的pH值应为7.2～7.4。
7细胞原种培养制备用选定的细胞系和培养基制备试验所需足够的细胞。使用冻存细胞时，如加有细胞保护剂应除去，使
用前至少传代培养一次。取出细胞，用适宜的酶分散法和／或机械分散法制备成细胞悬浮液。
———————————————
3）推荐的细胞系如CCL1（NCTCclone929），CCL163（Balb/3T3cloneA31）、CCL171（MRC-5）、CCL75（Wl-38）、CCL81（Vero）、CCL10[BHK-21(C-l3)和V-79379A。这一信息只是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。也可使用其他能得出相同或更佳结果的细胞系。
8试验步骤平行样数至少采用三个平行试验样品数和对照数。浸提液试验该试验用于细胞毒性定性和定量评价。从持续搅拌的细胞悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入浸提液接触的每只培养器皿内，轻轻转动培养器
皿使细胞均匀地分散在器皿的表面。根据培养基选择含或不含5%（体帜分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃士2℃温度下进行
培养。试验应在近汇合单层细胞或新鲜悬浮细胞上进行。如仅是检测克隆形成，应采用较低的细胞密度。
试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。试验可选用：
a)浸提原液；和b)以培养基作稀释剂的系列浸提稀释液。试验如果用单层细胞，应弃去培养器皿中的培养基，在每只器皿内加等量浸提液或上述稀释液。如用悬浮细胞进行试验，细胞悬浮液制备好后立即将浸提液或上述稀稀释液加到每只平行器皿中。采用水等非生理浸提液时，浸提液用培养基稀稀后应在最高生理相容浓度下试验。
注：建议在稀释浸提液时使用浓缩的（如2倍、5倍）培养基。
加等量的空白试剂和阴性及阳性对照液至其他平行器血中。
注：如需要，还可以用新新鲜培养基做对照试验。
器皿按8.中所述同样条件进行培养，培养期间应符合选定方法的要求。经过至少24h的培养后，接8.5确定细胞毒性反应。直接接触试验该试验用于细胞毒性定性和定量评价。从持续搅拌的细胞悬液中吸取等量的悬浮液，注入与试验样品直接接触的每只器皿内。轻轻水平转动器皿，使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。根据培养基选择含或不含5%（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养，直至培养细胞生长至近汇合。试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。弃去培养器皿中的培养基，加新鲜培养基至各器皿内。
在每只器皿中央部位的细胞层上各轻轻放置一个试验样品，应确保样品覆盖细胞层表面约十分之
操作时应注意防止样品不必耍的移动，否则可能会导致细胞的物理性损伤，这可从被移动细胞的
碎片来判断。
注：如可能，在细胞加入前将样品放入培养器皿内。
同法制备阴性和阳性对照材料平行器皿。
去除上层培养基，接确定细胞毒性反应。
间接接触试验
琼脂扩散试验
℃±2℃温度下进行培养，直至对数生长期末细胞近汇合。
注：各种不同分子量和纯度的琼脂可通用。
吸水性材料置于琼脂之前先用培养基进行湿化处理，以防止琼脂脱水。
用活体染色剂如中性红可有助于检测细胞毒性。活体染色剂可在培养前或培养后与样品一起加
入．如在培养前加，应在避光条件下进行细胞培养，以防因染色剂光活化作用而引起细胞损伤。
滤膜扩散试验
μm、无表面活性剂的滤膜，并加入等量持续搅拌的细胞悬浮液，轻轻水平转动培养皿使细胞均匀地分
散在每只滤膜的表面。
℃±2℃温度下进行培养，直至对数生长期末细胞近汇合。
±10min。
细胞毒性判定
可来用定性或定量方法检测细胞毒性。
a）定性评价：用显微镜检查细胞（如果需耍，使用细胞化学染色）评价诸如一般形态、空泡形成、
脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化，一般形态的改变可描述性地在试验报告中记录或以数字记
录，以下是给试验材料计分的有效方法。
细胞需性计分
含义
0
无细胞毒性
1
轻微细胞毒性
2
中度细胞毒性
3
重度细胞毒性
试验报告中应包括评价方法和评价结果。
b）定量评价：测定细胞死亡、细胞生长抑制、细胞繁殖或细胞克隆形成。可以用客观的方法对
细胞数量、蛋白总量、酶的释放、活体染料的释放和还原或其他可测定参数进行定量测试，使用的方
法和测试结果应在试验报告中记录。
注：一些检测细胞毒性的特殊方法，可能需要零点或基线细胞培养对照。
应慎重选择评价方法，试验样品如果释放对试验系统或对检测有影响的物质时，试验结果可能无效。
注：评价细胞活力，释放甲醛的材料须经过可靠的试验验证。
各平行培养皿的检测结果如有显着差异，则判定试验不当或无效。
阴性、阳性及任何其他对照物（参照、培养基、空白、试剂等）在试验系统中如无预期的反应，则应
重新检测。
9试验报告
试验报告应详细包括以下所有内容：
a）样品的描述；
b）细胞系并对选择进行论证；
c）培养基；d）评价方法和原理；
c）浸提步骤（如必要），如可能报告沥出物质的性质和浓度；
f）阴性、阳性和其他对照物；
g）细胞反应和其他情况；h）结果评价所需的其他有关资料。10结果评价应由合格的专业人员根据试验数据对试验结果进行总体评价。结果如没有说服力或者无效，应重做试验。
————————————————————
篇九：聚合物的阳性对照材料
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999医疗器械生物学评价
第5部分：体外细胞毒性试验1范围
GB/T16886的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵育;a）用器械的浸提液，和／或b)与器械接触。这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应。2规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T16886的本部分的引用而成为本部分的条款.凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验（GB/T16886.1—2001,idtISO109931:1997）CB/T16886.12-2000医疗器械生物学评价第12部分：样品制备和参照材料（idtISO1099312：1996)3术语与定义GB/T16886.1/ISO1993—1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分.3。1阴性对照材料negativecontrolmaterial按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。
注：阴性对照的目的是验证背景反应,例如高密度聚乙烯1）已作为合成聚合物的阴性对照材料，氧化陶瓷棒则用作牙科材料的阴性对照物。
3。2阳性对照材料positivecontrolmaterial
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999按照本部分试验时可重现细胞毒性反应的材料.
注：阳性对照的白目的是验证相应试验系统的反应，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯2）已用作固体材料和浸提液的阳性对照,酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。
_____________________________________1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会(Rockvillie，Maryland,USA）和Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729—5,Hanagawa.257—Japan）获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便,但ISO对使用该产品不提供担保。2)有机锡聚氯乙烯阳性对照材料可从SIMSPortexLtd,Hythe,Kent,CT216JL，UK（产品号码499-300—000）获得。ZDEC和ZDBC聚氨甲酸乙酯可从Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729—5，Hanagawa257—Japan）获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。
3。3试剂对照reagentcontrol在不加试验材料的条件下，按浸提条件和试验步骤得到的浸提介质。
注：在本部分中，该定义取代GB/T16886。12/lSO10993-12中3。1给出的定义。
3。4培养器皿culturevessels适用于细胞培养的器皿，包插玻璃培养皿、塑料培养瓶或塑料多孔培养板和微量滴定板等器皿。
注，在这些试验方法中，这些器皿只要符合组织培养级别的要求，并适用于哺乳动物细胞培养．可以互换使用。
3。5近汇合subconfluency在对数生长期末,约80％的细胞汇合。
4样品制备4.1总则
供试品可选用:a)材料浸提液；和／或B）材料本身。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999样品制备应符合CB/T16886.12/ISO10993—12。
4。2材料浸提液的制备4。2。1浸提原则
为了测定潜在的毒理学危害，浸提条件应模拟或严于临床使用条件，但不应导致试验材料发生，诸如熔化、溶解或化学结构改变等明显变化。
注：浸提液中任何内源性或外源性物质的浓度及其接触试验细胞的量取决于接触面积、浸提体积、pH、化学溶解度、扩散率、溶质度、搅拌、温度、时间和其他因素。
4。2.2浸提介质哺乳动物细胞检测中应使用下列一种或几种溶剂。对浸提介质的选择应进行验证:a）含血清培养基;b)无血清培养基；c）生理盐水溶液;d）其他适宜的溶剂。
注：溶剂的选择应反映出浸提的目的，并应考虑使用极性和非极性两种溶剂。适宜的溶剂包括纯水、植物油、二甲基亚砜(DMSO）.在所选择的测试系统中．如DMSO浓度大于0。5%（体积分数），则有细胞毒性。
4.2。3浸提条件4.2。3.1浸提应使用无菌技术，在无菌、化学惰性的封闭容器中进行,应符合GB/T16886。12/lSO10993-12的基本要求。4.2.3。2推荐的浸提条件是:
a）37℃±2℃下不少于24h；b）50℃±2℃下72h±2h；c)70℃±2℃下24h±2h；d）121℃±2℃下1h士0.2h。可根据器械特性和具体使用情况选择推荐的条件。当浸提过程使用含血清培养基时，只能来用4。2。3.2a）规定的浸提条件。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：19994。2.3。3浸提液用于细胞之前，如果进行过滤、离心或其他处置方法，最终报告(见第9章)中应予以说明,对浸提液pH值的调整也应在提告中说明。对浸提撞的处理，例如对pH值的调整会影响试验结果。4。3直接接触试验材料的制备4.3.1在细胞毒性检测中，多种形状、尺寸或物理状态（即液态或固态）的材料未经修整即可进行测试。
固体样品应至少有一个平面。其他形状和物理状态的样品应进行调整。4.3。2应考虑试验样品的无菌性.4。3。2.1无菌器械试验材料的试验全过程应按无菌操作法进行。4.3.2。2试验材料如取自通常在使用前灭菌的器械，应按照制造商提供的方法灭菌,并且试验全过程应按无菌操作法进行。用于试验系统之前，制备试验材料时应考虑灭菌方法或灭菌剂对器械的影响.4。3。2。3试撞材料如取自使用中不需要灭菌的器械,则应在供应状态下使用,但在试验全过程中应按无菌操作法进行。4。3。3对液体进行试验应:a）直接附着；或b）附着到具有生物惰性和吸收性的基质上.
注：滤膜是适用的基质。
4.3.4对高吸收性材料，如果可能，试验前应用培养基将其浸透,以防吸收试验器皿中的培养基.5细胞系5。1优先采用已建立的细胞系并应从认可的贮源获取3）5。2在需要特殊敏感性时，只能使用直接由活体组织获取的原代细胞、细胞系和器官型培养物，但需证明其反应的重现性和准确性。5.3细胞系原种培养贮存时，应放在相应培养基内，在—80℃或—80℃以下冻存，培养基内加有细胞保护剂，如二甲基亚砜或甘油等,长期贮存(几月至几年）只能在—130℃或—130℃以下冻存。5。4试验应使用无支原体污染细胞，使用前采用可靠方法检测是否存在支原体污染。6培养基
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：19996。1培养基应无菌。6.2含血清或无血清培养基应符合选定细胞系的生长要求.
注：培养基中允许含有对试验无不利影响的抗生素。培养基的稳定性与其成分和贮存条件有关。含谷氨酰胺和血清的培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过一周,含谷氨酰胺的无血清培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过2周。6.3培养基的pH值应为7.2～7。4。7细胞原种培养制备7.1用选定的细胞系和培养基制备试验所需足够的细胞。使用冻存细胞时，如加有细胞保护剂应除去,使用前至少传代培养一次。7.2取出细胞,用适宜的酶分散法和／或机械分散法制备成细胞悬浮液。—-—-—---————-——
3）推荐的细胞系如CCL1（NCTCclone929），CCL163（Balb/3T3cloneA31）、CCL171（MRC—5）、CCL75(Wl-38）、CCL81（Vero）、CCL10［BHK—21（C—l3)和V-79379A。这一信息只是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。也可使用其他能得出相同或更佳结果的细胞系。
8试验步骤8。1平行样数
至少采用三个平行试验样品数和对照数。8.2浸提液试验8.2.1该试验用于细胞毒性定性和定量评价。8。2。2从持续搅拌的细胞悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入浸提液接触的每只培养器皿内，轻轻转动培养器皿使细胞均匀地分散在器皿的表面。8。2。3根据培养基选择含或不含5％(体帜分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃士2℃温度下进行培养。
试验应在近汇合单层细胞或新鲜悬浮细胞上进行。如仅是检测克隆形成，应采用较低的细胞密度。8.2。4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：19998。2。5试验可选用：
a)浸提原液；和b）以培养基作稀释剂的系列浸提稀释液。试验如果用单层细胞，应弃去培养器皿中的培养基，在每只器皿内加等量浸提液或上述稀释液。如用悬浮细胞进行试验，细胞悬浮液制备好后立即将浸提液或上述稀稀释液加到每只平行器皿中。8。2.6采用水等非生理浸提液时，浸提液用培养基稀稀后应在最高生理相容浓度下试验。
注：建议在稀释浸提液时使用浓缩的(如2倍、5倍）培养基.
8.2.7加等量的空白试剂和阴性及阳性对照液至其他平行器血中.
注:如需要，还可以用新新鲜培养基做对照试验。
8.2.8器皿按8.2.3中所述同样条件进行培养，培养期间应符合选定方法的要求。8。2.9经过至少24h的培养后，接8.5确定细胞毒性反应。8.3直接接触试验8。3.1该试验用于细胞毒性定性和定量评价.8。3。2从持续搅拌的细胞悬液中吸取等量的悬浮液，注入与试验样品直接接触的每只器皿内。轻轻水平转动器皿，使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。8。3。3根据培养基选择含或不含5％（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养,直至培养细胞生长至近汇合。8.3.4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.3.5弃去培养器皿中的培养基,加新鲜培养基至各器皿内。8。3。6在每只器皿中央部位的细胞层上各轻轻放置一个试验样品，应确保样品覆盖细胞层表面约十分
之操作时应注意防止样品不必耍的移动，否则可能会导致细胞的物理性损伤，这可从被移动细胞的碎片来判断。
注:如可能,在细胞加入前将样品放入培养器皿内.
8.3。7同法制备阴性和阳性对照材料平行器皿。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：19998.3。8器皿按8。3。3中所述同样条件进行培养,培养期间（最少24h）应符合选定方法的要求.8.3.9去除上层培养基，接8。5确定细胞毒性反应。8。4间接接触试验8.4。1琼脂扩散试验8。4。1.1该试验用于细胞毒性定性评价,该方法不适用于不能通过琼脂层扩散的可沥滤物或与琼脂反应的物质。8.4.1。2从持续搅样的细跑悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入每只试验用平行器皿内.轻轻水平转动器皿．使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。8.4.1。3根据培养基选择含或不含5％（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养，直至对数生长期末细胞近汇合。8。4。1.4试验前用显微检查培养细胞的近汇合和形态情况。8。4.1。5弃去器皿中的培养基，然后将溶化琼脂与含血清的新鲜培养基混合,使琼脂最终质量浓度为0。5%～2％，每只器皿内加入等量的该混合液。只能使用适合于哺乳动物细胞生长的琼脂。该混合琼脂培养基应为液态，温度应适合于哺乳动物细胞。
注：各种不同分子量和纯度的琼脂可通用。
8。4。1.6将试验样品轻轻放在每只器血的固化琼脂层上，样品应覆盖细胞层表面约十分之一。吸水性材料置于琼脂之前先用培养基进行湿化处理，以防止琼脂脱水。
8。4。1。7同法制备阴性对照和阳性对照样品器皿。8.4.1.8按8。4。1。3中所述的同样条件培养24h～72h。8。4.1.9从琼脂上小心地取下样品之前、之后检测细胞毒性.。
用活体染色剂如中性红可有助于检测细胞毒性。活体染色剂可在培养前或培养后与样品一起加入．如在培养前加，应在避光条件下进行细胞培养，以防因染色剂光活化作用而引起细胞损伤。8.4.2滤膜扩散试验8.4。2.1该试验用于细胞毒性定性评价。8.4.2。2在数只试验用培养皿内,各放置一枚孔径0。45μm、无表面活性剂的滤膜，并加入等量持续搅拌的细胞悬浮液，轻轻水平转动培养皿使细胞均匀地分散在每只滤膜的表面。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999
8。4。2。3根据培养基选择含或不含5％（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养，直至对数生长期末细胞近汇合。
8.4。2。4试捡前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。
8.4。2.5弃去培养皿内的培养基,将滤膜细胞面向下．放在固化的琼脂层上（见8。4.1。6).
8。4.2.6轻经将试验样品放到滤膜无细胞面的上面．滤膜上放置不产生反应的环，用以保留提取液和新加入的成分.
8。4。2.7同法制备阴性和阳性对照样品滤膜。
8.4.2。8按8。4。2.3所述方法培养2h±10min。
8.4.2.9轻轻从滤膜上取下样品，并从琼脂面上小心分离开滤膜。
8。4.2。10采用合适的染色程序确定细胞毒性反应。
8。5细胞毒性判定
8。5.1可来用定性或定量方法检测细胞毒性。
a)定性评价：用显微镜检查细胞（如果需耍，使用细胞化学染色）评价诸如一般形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化，一般形态的改变可描述性地在试验报告中记录或以数字记录，以下是给试验材料计分的有效方法。
细胞需性计分
含义
0
无细胞毒性
1
轻微细胞毒性
2
中度细胞毒性
3
重度细胞毒性
试验报告中应包括评价方法和评价结果.
b)定量评价：测定细胞死亡、细胞生长抑制、细胞繁殖或细胞克隆形成。可以用客观的方法对细胞数量、蛋白总量、酶的释放、活体染料的释放和还原或其他可测定参数进行定量测试，使用的方法和测试结果应在试验报告中记录。
注：一些检测细胞毒性的特殊方法,可能需要零点或基线细胞培养对照。
8.5.2应慎重选择评价方法,试验样品如果释放对试验系统或对检测有影响的物质时，试验结果可能无效.
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999
注:评价细胞活力，释放甲醛的材料须经过可靠的试验验证。
8。5。3各平行培养皿的检测结果如有显著差异，则判定试验不当或无效。8。5。4阴性、阳性及任何其他对照物（参照、培养基、空白、试剂等)在试验系统中如无预期的反应，则应重新检测。9试验报告
试验报告应详细包括以下所有内容：a）样品的描述；b)细胞系并对选择进行论证;c）培养基；d）评价方法和原理；c）浸提步骤(如必要),如可能报告沥出物质的性质和浓度;f)阴性、阳性和其他对照物；g)细胞反应和其他情况；h）结果评价所需的其他有关资料。10结果评价应由合格的专业人员根据试验数据对试验结果进行总体评价。结果如没有说服力或者无效，应重做试验。
—---—-——--———-—-————
篇十：聚合物的阳性对照材料
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999医疗器械生物学评价
第5部分：体外细胞毒性试验
1范围GB/T16886的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵育；a）用器械的浸提液，和／或b)与器械接触。这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应.
2规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T16886的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件,
其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本部分.
GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验（GB/T16886.1-2001，idtISO10993—1:1997)
CB/T16886.12-2000医疗器械生物学评价第12部分：样品制备和参照材料（idtISO1099312：1996）
3术语与定义GB/T16886.1/ISO1993-1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。
3.1阴性对照材料negativecontrolmaterial
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。
注：阴性对照的目的是验证背景反应，例如高密度聚乙烯1）已作为合成聚合物的阴性对照材料，氧化陶瓷棒则用作牙科材料的阴性对照物。
3.2阳性对照材料positivecontrolmaterial按照本部分试验时可重现细胞毒性反应的材料.
注：阳性对照的白目的是验证相应试验系统的反应，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯2）已用作固体材料和浸提液的阳性对照，酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。
_____________________________________1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会（Rockvillie,Maryland,USA）和Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5，Hanagawa.257—Japan)获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。2)有机锡聚氯乙烯阳性对照材料可从SIMSPortexLtd,Hythe,Kent，CT216JL，UK（产品号码499-300-000）获得。ZDEC和ZDBC聚氨甲酸乙酯可从Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5,Hanagawa257-Japan）获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999
3)
3。3试剂对照reagentcontrol在不加试验材料的条件下，按浸提条件和试验步骤得到的浸提介质。
注:在本部分中，该定义取代GB/T16886.12/lSO10993-12中3.1给出的定义。
3。4培养器皿culturevessels适用于细胞培养的器皿，包插玻璃培养皿、塑料培养瓶或塑料多孔培养板和微量滴定板等器皿.
注，在这些试验方法中，这些器皿只要符合组织培养级别的要求，并适用于哺乳动物细胞培养．可以互换使用。
3。5近汇合subconfluency在对数生长期末，约80％的细胞汇合。
4样品制备4.1总则
供试品可选用:a）材料浸提液;和／或B)材料本身.样品制备应符合CB/T16886.12/ISO10993—12。4.2材料浸提液的制备4。2.1浸提原则为了测定潜在的毒理学危害,浸提条件应模拟或严于临床使用条件，但不应导致试验材料发生，诸如熔化、溶解或化学结构改变等明显变化。
注：浸提液中任何内源性或外源性物质的浓度及其接触试验细胞的量取决于接触面积、浸提体积、pH、化学溶解度、扩散率、溶质度、搅拌、温度、时间和其他因素.
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：19994.2。2浸提介质
哺乳动物细胞检测中应使用下列一种或几种溶剂.对浸提介质的选择应进行验证:a)含血清培养基；b）无血清培养基；c)生理盐水溶液；d)其他适宜的溶剂。
注：溶剂的选择应反映出浸提的目的，并应考虑使用极性和非极性两种溶剂。适宜的溶剂包括纯水、植物油、二甲基亚砜(DMSO）。在所选择的测试系统中．如DMSO浓度大于0。5%（体积分数）,则有细胞毒性。
4.2.3浸提条件4.2.3.1浸提应使用无菌技术，在无菌、化学惰性的封闭容器中进行,应符合GB/T16886。12/lSO10993-12的基本要求。4.2。3.2推荐的浸提条件是:
a）37℃±2℃下不少于24h;b)50℃±2℃下72h±2h；c）70℃±2℃下24h±2h;d)121℃±2℃下1h士0.2h。可根据器械特性和具体使用情况选择推荐的条件。当浸提过程使用含血清培养基时,只能来用4。2。3.2a）规定的浸提条件。4.2。3。3浸提液用于细胞之前,如果进行过滤、离心或其他处置方法,最终报告（见第9章)中应予以说明，对浸提液pH值的调整也应在提告中说明。对浸提撞的处理，例如对pH值的调整会影响试验结果。4.3直接接触试验材料的制备4.3.1在细胞毒性检测中，多种形状、尺寸或物理状态（即液态或固态）的材料未经修整即可进行测试。固体样品应至少有一个平面。其他形状和物理状态的样品应进行调整。4。3。2应考虑试验样品的无菌性。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：19994.3。2.1无菌器械试验材料的试验全过程应按无菌操作法进行。4。3。2.2试验材料如取自通常在使用前灭菌的器械，应按照制造商提供的方法灭菌，并且试验全过程应按无菌操作法进行。
用于试验系统之前,制备试验材料时应考虑灭菌方法或灭菌剂对器械的影响.4。3.2.3试撞材料如取自使用中不需要灭菌的器械，则应在供应状态下使用，但在试验全过程中应按无菌操作法进行.4。3.3对液体进行试验应：
a）直接附着;或b）附着到具有生物惰性和吸收性的基质上.
注：滤膜是适用的基质。
4.3。4对高吸收性材料，如果可能，试验前应用培养基将其浸透,以防吸收试验器皿中的培养基。
5细胞系5。1优先采用已建立的细胞系并应从认可的贮源获取3）5.2在需要特殊敏感性时，只能使用直接由活体组织获取的原代细胞、细胞系和器官型培养物，但需证明其反应的重现性和准确性.5。3细胞系原种培养贮存时，应放在相应培养基内，在—80℃或-80℃以下冻存,培养基内加有细胞保护剂，如二甲基亚砜或甘油等，长期贮存（几月至几年）只能在—130℃或—130℃以下冻存。5.4试验应使用无支原体污染细胞，使用前采用可靠方法检测是否存在支原体污染。
6培养基6。1培养基应无菌。6.2含血清或无血清培养基应符合选定细胞系的生长要求。
注：培养基中允许含有对试验无不利影响的抗生素。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999培养基的稳定性与其成分和贮存条件有关。含谷氨酰胺和血清的培养基在2℃~8℃条件下贮存不超
过一周,含谷氨酰胺的无血清培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过2周.6.3培养基的pH值应为7。2～7。4.7细胞原种培养制备
7.1用选定的细胞系和培养基制备试验所需足够的细胞。使用冻存细胞时，如加有细胞保护剂应除去，使用前至少传代培养一次。
7.2取出细胞，用适宜的酶分散法和／或机械分散法制备成细胞悬浮液。————————-————--
3)推荐的细胞系如CCL1（NCTCclone929），CCL163（Balb/3T3cloneA31）、CCL171（MRC-5）、CCL75(Wl-38）、CCL81（Vero）、CCL10[BHK—21(C—l3）和V-79379A.这一信息只是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。也可使用其他能得出相同或更佳结果的细胞系。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999
8试验步骤8。1平行样数
至少采用三个平行试验样品数和对照数。8。2浸提液试验8。2。1该试验用于细胞毒性定性和定量评价.8.2.2从持续搅拌的细胞悬浮液中吸取等量的悬浮液,注入浸提液接触的每只培养器皿内，轻轻转动培养器皿使细胞均匀地分散在器皿的表面。8。2。3根据培养基选择含或不含5%（体帜分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃士2℃温度下进行培养。
试验应在近汇合单层细胞或新鲜悬浮细胞上进行。如仅是检测克隆形成，应采用较低的细胞密度。8。2.4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况.8.2.5试验可选用：a)浸提原液；和b）以培养基作稀释剂的系列浸提稀释液.试验如果用单层细胞，应弃去培养器皿中的培养基，在每只器皿内加等量浸提液或上述稀释液。如用悬浮细胞进行试验，细胞悬浮液制备好后立即将浸提液或上述稀稀释液加到每只平行器皿中。8。2。6采用水等非生理浸提液时，浸提液用培养基稀稀后应在最高生理相容浓度下试验.
注:建议在稀释浸提液时使用浓缩的（如2倍、5倍）培养基.
8.2.7加等量的空白试剂和阴性及阳性对照液至其他平行器血中.
注：如需要，还可以用新新鲜培养基做对照试验。
8。2。8器皿按8。2。3中所述同样条件进行培养，培养期间应符合选定方法的要求。8。2.9经过至少24h的培养后，接8。5确定细胞毒性反应。8.3直接接触试验
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：19998。3.1该试验用于细胞毒性定性和定量评价。8.3。2从持续搅拌的细胞悬液中吸取等量的悬浮液，注入与试验样品直接接触的每只器皿内。轻轻水平转动器皿，使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。
8。3.3根据培养基选择含或不含5%（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统,在37℃±2℃温度下进行培养，直至培养细胞生长至近汇合。
8。3.4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.3.5弃去培养器皿中的培养基，加新鲜培养基至各器皿内.8.3。6在每只器皿中央部位的细胞层上各轻轻放置一个试验样品，应确保样品覆盖细胞层表面约十分之
操作时应注意防止样品不必耍的移动，否则可能会导致细胞的物理性损伤,这可从被移动细胞的碎片来判断。
注：如可能，在细胞加入前将样品放入培养器皿内。
8.3.7同法制备阴性和阳性对照材料平行器皿.8.3.8器皿按8。3.3中所述同样条件进行培养,培养期间（最少24h)应符合选定方法的要求。8。3.9去除上层培养基，接8。5确定细胞毒性反应。8。4间接接触试验
8。4。1琼脂扩散试验
8.4。1.1该试验用于细胞毒性定性评价,该方法不适用于不能通过琼脂层扩散的可沥滤物或与琼脂反应的物质。
8。4。1。2从持续搅样的细跑悬浮液中吸取等量的悬浮液,注入每只试验用平行器皿内。轻轻水平转动器皿．使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。
8。4.1。3根据培养基选择含或不含5%（体积分数)二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养,直至对数生长期末细胞近汇合。8。4。1。4试验前用显微检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.4.1。5弃去器皿中的培养基，然后将溶化琼脂与含血清的新鲜培养基混合，使琼脂最终质量浓度为0.5%~2%,每只器皿内加入等量的该混合液.只能使用适合于哺乳动物细胞生长的琼脂。该混合琼脂培养基应为液态，温度应适合于哺乳动物细胞。
注：各种不同分子量和纯度的琼脂可通用。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：19998.4.1.6将试验样品轻轻放在每只器血的固化琼脂层上,样品应覆盖细胞层表面约十分之一.
吸水性材料置于琼脂之前先用培养基进行湿化处理，以防止琼脂脱水。8。4.1.7同法制备阴性对照和阳性对照样品器皿。8。4。1。8按8.4.1。3中所述的同样条件培养24h~72h.8.4.1。9从琼脂上小心地取下样品之前、之后检测细胞毒性.。
用活体染色剂如中性红可有助于检测细胞毒性.活体染色剂可在培养前或培养后与样品一起加入．如在培养前加，应在避光条件下进行细胞培养，以防因染色剂光活化作用而引起细胞损伤.8。4.2滤膜扩散试验8。4。2.1该试验用于细胞毒性定性评价。8.4.2.2在数只试验用培养皿内,各放置一枚孔径0。45μm、无表面活性剂的滤膜,并加入等量持续搅拌的细胞悬浮液,轻轻水平转动培养皿使细胞均匀地分散在每只滤膜的表面。8。4.2。3根据培养基选择含或不含5%（体积分数)二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养，直至对数生长期末细胞近汇合.8.4.2.4试捡前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.4。2。5弃去培养皿内的培养基，将滤膜细胞面向下．放在固化的琼脂层上（见8.4.1。6）.8。4。2.6轻经将试验样品放到滤膜无细胞面的上面．滤膜上放置不产生反应的环，用以保留提取液和新加入的成分。8.4.2.7同法制备阴性和阳性对照样品滤膜.8。4.2.8按8。4。2.3所述方法培养2h±10min。8.4。2.9轻轻从滤膜上取下样品，并从琼脂面上小心分离开滤膜.8.4.2。10采用合适的染色程序确定细胞毒性反应。8.5细胞毒性判定8.5.1可来用定性或定量方法检测细胞毒性。
a)定性评价:用显微镜检查细胞(如果需耍,使用细胞化学染色）评价诸如一般形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化，一般形态的改变可描述性地在试验报告中记录或以数字记录，以下是给试验材料计分的有效方法.
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999
细胞需性计分
含义
0
无细胞毒性
1
轻微细胞毒性
2
中度细胞毒性
3
重度细胞毒性
试验报告中应包括评价方法和评价结果。
b）定量评价:测定细胞死亡、细胞生长抑制、细胞繁殖或细胞克隆形成。可以用客观的方法对细胞数量、蛋白总量、酶的释放、活体染料的释放和还原或其他可测定参数进行定量测试，使用的方法和测试结果应在试验报告中记录.
注:一些检测细胞毒性的特殊方法，可能需要零点或基线细胞培养对照.
8.5.2应慎重选择评价方法，试验样品如果释放对试验系统或对检测有影响的物质时，试验结果可能无效。
注：评价细胞活力，释放甲醛的材料须经过可靠的试验验证。
8.5。3各平行培养皿的检测结果如有显著差异，则判定试验不当或无效。
8.5.4阴性、阳性及任何其他对照物（参照、培养基、空白、试剂等）在试验系统中如无预期的反应,则应重新检测。
9试验报告
试验报告应详细包括以下所有内容:
a）样品的描述；
b）细胞系并对选择进行论证；
c）培养基；
d）评价方法和原理；
c）浸提步骤（如必要）,如可能报告沥出物质的性质和浓度；
f）阴性、阳性和其他对照物；
g）细胞反应和其他情况;
h）结果评价所需的其他有关资料。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：199910结果评价
应由合格的专业人员根据试验数据对试验结果进行总体评价。结果如没有说服力或者无效，应重做试验。
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篇十一：聚合物的阳性对照材料
P> 医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验1范围GB/T16886的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵育；a)用器械的浸提液，和／或b)与器械接触。这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应.
2规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T16886的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，
其随后所有的修改单(不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分:评价与试验（GB/T16886。1—2001，idtISO10993—1：1997）
CB/T16886.12—2000医疗器械生物学评价第12部分：样品制备和参照材料（idtISO10993—12:1996）
3术语与定义GB/T16886。1/ISO1993-1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。
3。1阴性对照材料negativecontrolmaterial
按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。
注：阴性对照的目的是验证背景反应，例如高密度聚乙烯1）已作为合成聚合物的阴性对照材料，氧化陶瓷棒则用作牙科材料的阴性对照物。
3。2阳性对照材料positivecontrolmaterial按照本部分试验时可重现细胞毒性反应的材料。
注：阳性对照的白目的是验证相应试验系统的反应，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯2）已用作固体材料和浸提液的阳性对照，酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。
_____________________________________1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会（Rockvillie，Maryland,USA）和Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5，Hanagawa。257—Japan）获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。2)有机锡聚氯乙烯阳性对照材料可从SIMSPortexLtd，Hythe，Kent，CT216JL,UK（产品号码499—300—000）获得。ZDEC和ZDBC聚氨甲酸乙酯可从Hatano研究所食品和药品安全中心(Ochiai729—5,Hanagawa257—Japan）获得.提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。
3)
3.3试剂对照reagentcontrol在不加试验材料的条件下，按浸提条件和试验步骤得到的浸提介质。
注：在本部分中，该定义取代GB/T16886.12/lSO10993-12中3.1给出的定义。
3.4培养器皿culturevessels适用于细胞培养的器皿，包插玻璃培养皿、塑料培养瓶或塑料多孔培养板和微量滴定板等器皿。
注，在这些试验方法中，这些器皿只要符合组织培养级别的要求，并适用于哺乳动物细胞培养．可以互换使用。
3.5近汇合subconfluency在对数生长期末，约80%的细胞汇合。
4样品制备4.1总则
供试品可选用：a）材料浸提液；和／或B）材料本身.样品制备应符合CB/T16886.12/ISO10993—12。4.2材料浸提液的制备4。2。1浸提原则为了测定潜在的毒理学危害,浸提条件应模拟或严于临床使用条件,但不应导致试验材料发生，诸如熔化、溶解或化学结构改变等明显变化。
注:浸提液中任何内源性或外源性物质的浓度及其接触试验细胞的量取决于接触面积、浸提体积、pH、化学溶解度、扩散率、溶质度、搅拌、温度、时间和其他因素.
4。2。2浸提介质哺乳动物细胞检测中应使用下列一种或几种溶剂。对浸提介质的选择应进行验证:a)含血清培养基；b)无血清培养基;c）生理盐水溶液；d）其他适宜的溶剂。
注:溶剂的选择应反映出浸提的目的，并应考虑使用极性和非极性两种溶剂。适宜的溶剂包括纯水、植物油、二甲基亚砜（DMSO)。在所选择的测试系统中．如DMSO浓度大于0。5％(体积分数)，则有细胞毒性.
4。2。3浸提条件4。2。3.1浸提应使用无菌技术，在无菌、化学惰性的封闭容器中进行,应符合GB/T16886。12/lSO10993—12的基本要求.4。2。3。2推荐的浸提条件是:
a）37℃±2℃下不少于24h；b)50℃±2℃下72h±2h；c）70℃±2℃下24h±2h；d）121℃±2℃下1h士0。2h。可根据器械特性和具体使用情况选择推荐的条件。当浸提过程使用含血清培养基时，只能来用4。2.3.2a）规定的浸提条件。4。2。3.3浸提液用于细胞之前,如果进行过滤、离心或其他处置方法，最终报告（见第9章）中应予以说明，对浸提液pH值的调整也应在提告中说明.对浸提撞的处理,例如对pH值的调整会影响试验结果。4。3直接接触试验材料的制备4。3.1在细胞毒性检测中，多种形状、尺寸或物理状态（即液态或固态)的材料未经修整即可进行测试。固体样品应至少有一个平面.其他形状和物理状态的样品应进行调整。4.3。2应考虑试验样品的无菌性。
4。3.2.1无菌器械试验材料的试验全过程应按无菌操作法进行。4.3。2.2试验材料如取自通常在使用前灭菌的器械，应按照制造商提供的方法灭菌，并且试验全过程应按无菌操作法进行。
用于试验系统之前,制备试验材料时应考虑灭菌方法或灭菌剂对器械的影响.4。3.2.3试撞材料如取自使用中不需要灭菌的器械,则应在供应状态下使用，但在试验全过程中应按无菌操作法进行。4.3.3对液体进行试验应：
a）直接附着；或b)附着到具有生物惰性和吸收性的基质上。
注：滤膜是适用的基质。
4。3.4对高吸收性材料，如果可能,试验前应用培养基将其浸透,以防吸收试验器皿中的培养基。
5细胞系5。1优先采用已建立的细胞系并应从认可的贮源获取3)5.2在需要特殊敏感性时,只能使用直接由活体组织获取的原代细胞、细胞系和器官型培养物，但需证明其反应的重现性和准确性。5。3细胞系原种培养贮存时，应放在相应培养基内，在-80℃或-80℃以下冻存，培养基内加有细胞保护剂，如二甲基亚砜或甘油等,长期贮存(几月至几年）只能在—130℃或—130℃以下冻存。5.4试验应使用无支原体污染细胞，使用前采用可靠方法检测是否存在支原体污染。
6培养基6.1培养基应无菌。6。2含血清或无血清培养基应符合选定细胞系的生长要求。
注：培养基中允许含有对试验无不利影响的抗生素.
培养基的稳定性与其成分和贮存条件有关。含谷氨酰胺和血清的培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过一周，含谷氨酰胺的无血清培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过2周。
6。3培养基的pH值应为7。2～7.4。
7细胞原种培养制备
7。1用选定的细胞系和培养基制备试验所需足够的细胞。使用冻存细胞时，如加有细胞保护剂应除去，使用前至少传代培养一次。
7.2取出细胞，用适宜的酶分散法和／或机械分散法制备成细胞悬浮液。
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3）推荐的细胞系如CCL1(NCTCclone929）,CCL163(Balb/3T3cloneA31）、CCL171（MRC—5）、CCL75（Wl-38)、CCL81（Vero）、CCL10[BHK-21（C-l3）和V—79379A。这一信息只是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保.也可使用其他能得出相同或更佳结果的细胞系.
8试验步骤8。1平行样数
至少采用三个平行试验样品数和对照数。8.2浸提液试验8.2.1该试验用于细胞毒性定性和定量评价.8.2.2从持续搅拌的细胞悬浮液中吸取等量的悬浮液,注入浸提液接触的每只培养器皿内,轻轻转动培养器皿使细胞均匀地分散在器皿的表面.8.2.3根据培养基选择含或不含5%（体帜分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃士2℃温度下进行培养。
试验应在近汇合单层细胞或新鲜悬浮细胞上进行.如仅是检测克隆形成，应采用较低的细胞密度。8.2.4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8。2.5试验可选用：a）浸提原液；和b)以培养基作稀释剂的系列浸提稀释液。试验如果用单层细胞，应弃去培养器皿中的培养基，在每只器皿内加等量浸提液或上述稀释液。如用悬浮细胞进行试验，细胞悬浮液制备好后立即将浸提液或上述稀稀释液加到每只平行器皿中。8.2.6采用水等非生理浸提液时，浸提液用培养基稀稀后应在最高生理相容浓度下试验.
注:建议在稀释浸提液时使用浓缩的(如2倍、5倍）培养基.
8。2。7加等量的空白试剂和阴性及阳性对照液至其他平行器血中.
注：如需要，还可以用新新鲜培养基做对照试验。
8.2。8器皿按8。2。3中所述同样条件进行培养，培养期间应符合选定方法的要求.8。2。9经过至少24h的培养后，接8。5确定细胞毒性反应。8.3直接接触试验
8.3.1该试验用于细胞毒性定性和定量评价。8。3。2从持续搅拌的细胞悬液中吸取等量的悬浮液,注入与试验样品直接接触的每只器皿内。轻轻水平转动器皿,使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。8。3。3根据培养基选择含或不含5％（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养，直至培养细胞生长至近汇合。
8.3。4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.3。5弃去培养器皿中的培养基，加新鲜培养基至各器皿内。8。3.6在每只器皿中央部位的细胞层上各轻轻放置一个试验样品,应确保样品覆盖细胞层表面约十分之
操作时应注意防止样品不必耍的移动，否则可能会导致细胞的物理性损伤，这可从被移动细胞的碎片来判断。
注：如可能，在细胞加入前将样品放入培养器皿内。
8。3.7同法制备阴性和阳性对照材料平行器皿.8。3.8器皿按8.3。3中所述同样条件进行培养，培养期间（最少24h)应符合选定方法的要求。8。3.9去除上层培养基，接8。5确定细胞毒性反应.8.4间接接触试验
8。4。1琼脂扩散试验
8。4.1.1该试验用于细胞毒性定性评价，该方法不适用于不能通过琼脂层扩散的可沥滤物或与琼脂反应的物质。
8.4.1。2从持续搅样的细跑悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入每只试验用平行器皿内.轻轻水平转动器皿．使细胞均匀地分散在每只器皿的表面.8.4。1。3根据培养基选择含或不含5％（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养,直至对数生长期末细胞近汇合。8.4。1。4试验前用显微检查培养细胞的近汇合和形态情况。8。4。1.5弃去器皿中的培养基，然后将溶化琼脂与含血清的新鲜培养基混合，使琼脂最终质量浓度为0。5%～2％，每只器皿内加入等量的该混合液。只能使用适合于哺乳动物细胞生长的琼脂。该混合琼脂培养基应为液态，温度应适合于哺乳动物细胞.
注：各种不同分子量和纯度的琼脂可通用。
8.4。1.6将试验样品轻轻放在每只器血的固化琼脂层上，样品应覆盖细胞层表面约十分之一。吸水性材料置于琼脂之前先用培养基进行湿化处理，以防止琼脂脱水。
8。4.1.7同法制备阴性对照和阳性对照样品器皿.8.4。1。8按8.4.1。3中所述的同样条件培养24h～72h.8.4。1.9从琼脂上小心地取下样品之前、之后检测细胞毒性.。
用活体染色剂如中性红可有助于检测细胞毒性。活体染色剂可在培养前或培养后与样品一起加入．如在培养前加,应在避光条件下进行细胞培养，以防因染色剂光活化作用而引起细胞损伤。8.4.2滤膜扩散试验8。4.2。1该试验用于细胞毒性定性评价.8.4。2.2在数只试验用培养皿内,各放置一枚孔径0。45μm、无表面活性剂的滤膜,并加入等量持续搅拌的细胞悬浮液，轻轻水平转动培养皿使细胞均匀地分散在每只滤膜的表面。8。4.2.3根据培养基选择含或不含5%(体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养，直至对数生长期末细胞近汇合。8。4.2.4试捡前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.4。2.5弃去培养皿内的培养基,将滤膜细胞面向下．放在固化的琼脂层上（见8.4.1.6）。8.4。2.6轻经将试验样品放到滤膜无细胞面的上面．滤膜上放置不产生反应的环，用以保留提取液和新加入的成分。8。4.2。7同法制备阴性和阳性对照样品滤膜。8。4。2。8按8。4。2。3所述方法培养2h±10min。8。4。2.9轻轻从滤膜上取下样品，并从琼脂面上小心分离开滤膜。8。4。2.10采用合适的染色程序确定细胞毒性反应.8.5细胞毒性判定8.5。1可来用定性或定量方法检测细胞毒性。
a)定性评价：用显微镜检查细胞（如果需耍，使用细胞化学染色）评价诸如一般形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化,一般形态的改变可描述性地在试验报告中记录或以数字记录，以下是给试验材料计分的有效方法。
细胞需性计分
含义
0
无细胞毒性
1
轻微细胞毒性
2
中度细胞毒性
3
重度细胞毒性
试验报告中应包括评价方法和评价结果。
b）定量评价：测定细胞死亡、细胞生长抑制、细胞繁殖或细胞克隆形成。可以用客观的方法对细胞数量、蛋白总量、酶的释放、活体染料的释放和还原或其他可测定参数进行定量测试,使用的方法和测试结果应在试验报告中记录。
注：一些检测细胞毒性的特殊方法，可能需要零点或基线细胞培养对照。
8.5.2应慎重选择评价方法,试验样品如果释放对试验系统或对检测有影响的物质时，试验结果可能无效。
注：评价细胞活力，释放甲醛的材料须经过可靠的试验验证。
8.5.3各平行培养皿的检测结果如有显著差异，则判定试验不当或无效。
8.5.4阴性、阳性及任何其他对照物（参照、培养基、空白、试剂等)在试验系统中如无预期的反应，则应重新检测.
9试验报告
试验报告应详细包括以下所有内容：
a）样品的描述；b)细胞系并对选择进行论证；c)培养基；d）评价方法和原理；c）浸提步骤（如必要)，如可能报告沥出物质的性质和浓度；f）阴性、阳性和其他对照物；g）细胞反应和其他情况;h)结果评价所需的其他有关资料。
10结果评价应由合格的专业人员根据试验数据对试验结果进行总体评价。结果如没有说服力或者无效，应重做
试验。———————————-—-——-—--
篇十二：聚合物的阳性对照材料
P> 医疗
器
械
生
物
学
评
价
第5部分：体外细胞毒性试验
1范围GB/T16886的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵育；a）用器械的浸提液，和／或b）与器械接触。这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应。
2规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T16886的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的
引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验（GB/T16886.1-2001,idtISO10993-1:1997）
CB/T16886.12-2000医疗器械生物学评价第12部分：样品制备和参照材料（idtISO1099312:1996）3术语与定义
GB/T16886.1/ISO1993-1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。3.1
阴性对照材料negativecontrolmaterial按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。
注：阴性对照的目的是验证背景反应，例如高密度聚乙烯1）已作为合成聚合物的阴性对照材料，氧化陶瓷棒则用作牙科材料的阴性对照物。
3.2阳性对照材料positivecontrolmaterial按照本部分试验时可重现细胞毒性反应的材料。
注：阳性对照的白目的是验证相应试验系统的反应，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯2）已用作固体材料和浸提液的阳性对照，酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。
_____________________________________1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会（Rockvillie,Maryland,USA）和Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5,Hanagawa.257-Japan）获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。2)有机锡聚氯乙烯阳性对照材料可从SIMSPortexLtd,Hythe,Kent,CT216JL,UK（产品号码499-300-000）获得。ZDEC和ZDBC聚氨甲酸乙酯可从Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5,Hanagawa257-Japan)获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。
3.3试剂对照reagentcontrol在不加试验材料的条件下，按浸提条件和试验步骤得到的浸提介质。
注：在本部分中，该定义取代GB/T16886.12/lSO10993-12中3.1给出的定义。
3.4培养器皿culturevessels适用于细胞培养的器皿，包插玻璃培养皿、塑料培养瓶或塑料多孔培养板和微量滴定板等器皿。
注，在这些试验方法中，这些器皿只要符合组织培养级别的要求，并适用于哺乳动物细胞培养．可以互换使用。
3.5近汇合subconfluency在对数生长期末，约80%的细胞汇合。
4样品制备4.1总则
供试品可选用：
a）材料浸提液；和／或B）材料本身。样品制备应符合CB/T16886.12/ISO10993-12。4.2材料浸提液的制备4.2.1浸提原则为了测定潜在的毒理学危害，浸提条件应模拟或严于临床使用条件，但不应导致试验材料发生，诸如熔化、溶解或化学结构改变等明显变化。
注：浸提液中任何内源性或外源性物质的浓度及其接触试验细胞的量取决于接触面积、浸提体积、pH、化学溶解度、扩散率、溶质度、搅拌、温度、时间和其他因素。
4.2.2浸提介质哺乳动物细胞检测中应使用下列一种或几种溶剂。对浸提介质的选择应进行验证：a)含血清培养基；b)无血清培养基；c)生理盐水溶液；d)其他适宜的溶剂。
注：溶剂的选择应反映出浸提的目的，并应考虑使用极性和非极性两种溶剂。适宜的溶剂包括纯水、植物油、二甲基亚砜（DMSO）。在所选择的测试系统中．如DMSO浓度大于0.5%（体积分数），则有细胞毒性。
4.2.3浸提条件4.2.3.1浸提应使用无菌技术，在无菌、化学惰性的封闭容器中进行，应符合GB/T16886.12/lSO10993-12的基本要求。4.2.3.2推荐的浸提条件是：
a)37℃±2℃下不少于24h；b)50℃±2℃下72h±2h；c)70℃±2℃下24h±2h；d)121℃±2℃下1h士0.2h。
可根据器械特性和具体使用情况选择推荐的条件。当浸提过程使用含血清培养基时，只能来用4.2.3.2a）规定的浸提条件。4.2.3.3浸提液用于细胞之前，如果进行过滤、离心或其他处置方法，最终报告（见第9章）中应予以说明，对浸提液pH值的调整也应在提告中说明。对浸提撞的处理，例如对pH值的调整会影响试验结果。4.3直接接触试验材料的制备4.3.1在细胞毒性检测中，多种形状、尺寸或物理状态（即液态或固态）的材料未经修整即可进行测试。固体样品应至少有一个平面。其他形状和物理状态的样品应进行调整。4.3.2应考虑试验样品的无菌性。4.3.2.1无菌器械试验材料的试验全过程应按无菌操作法进行。4.3.2.2试验材料如取自通常在使用前灭菌的器械，应按照制造商提供的方法灭菌，并且试验全过程应按无菌操作法进行。用于试验系统之前，制备试验材料时应考虑灭菌方法或灭菌剂对器械的影响。4.3.2.3试撞材料如取自使用中不需要灭菌的器械，则应在供应状态下使用，但在试验全过程中应按无菌操作法进行。4.3.3对液体进行试验应：a）直接附着；或b）附着到具有生物惰性和吸收性的基质上。
注：滤膜是适用的基质。
4.3.4对高吸收性材料，如果可能，试验前应用培养基将其浸透，以防吸收试验器皿中的培养基。5细胞系5.1优先采用已建立的细胞系并应从认可的贮源获取3）5.2在需要特殊敏感性时，只能使用直接由活体组织获取的原代细胞、细胞系和器官型培养物，但需证明其反应的重现性和准确性。5.3细胞系原种培养贮存时，应放在相应培养基内，在-80℃或-80℃以下冻存，培养基内加有细胞保护剂，如二甲基亚砜或甘油等，长期贮存（几月至几年）只能在-130℃或-130℃以下冻存。
5.4试验应使用无支原体污染细胞，使用前采用可靠方法检测是否存在支原体污染。6培养基6.1培养基应无菌。6.2含血清或无血清培养基应符合选定细胞系的生长要求。
注：培养基中允许含有对试验无不利影响的抗生素。培养基的稳定性与其成分和贮存条件有关。含谷氨酰胺和血清的培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过一周，含谷氨酰胺的无血清培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过2周。6.3培养基的pH值应为7.2～7.4。7细胞原种培养制备7.1用选定的细胞系和培养基制备试验所需足够的细胞。使用冻存细胞时，如加有细胞保护剂应除去，使用前至少传代培养一次。7.2取出细胞，用适宜的酶分散法和／或机械分散法制备成细胞悬浮液。———————————————
3）推荐的细胞系如CCL1（NCTCclone929），CCL163（Balb/3T3cloneA31）、CCL171（MRC-5）、CCL75（Wl-38）、CCL81（Vero）、CCL10[BHK-21(C-l3)和V-79379A。这一信息只是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。也可使用其他能得出相同或更佳结果的细胞系。
8试验步骤8.1平行样数
至少采用三个平行试验样品数和对照数。8.2浸提液试验8.2.1该试验用于细胞毒性定性和定量评价。8.2.2从持续搅拌的细胞悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入浸提液接触的每只培养器皿内，轻轻转动培养器皿使细胞均匀地分散在器皿的表面。8.2.3根据培养基选择含或不含5%（体帜分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃士2℃温度下进行培养。
试验应在近汇合单层细胞或新鲜悬浮细胞上进行。
如仅是检测克隆形成，应采用较低的细胞密度。8.2.4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.2.5试验可选用：
a)浸提原液；和b)以培养基作稀释剂的系列浸提稀释液。试验如果用单层细胞，应弃去培养器皿中的培养基，在每只器皿内加等量浸提液或上述稀释液。如用悬浮细胞进行试验，细胞悬浮液制备好后立即将浸提液或上述稀稀释液加到每只平行器皿中。8.2.6采用水等非生理浸提液时，浸提液用培养基稀稀后应在最高生理相容浓度下试验。
注：建议在稀释浸提液时使用浓缩的（如2倍、5倍）培养基。
8.2.7加等量的空白试剂和阴性及阳性对照液至其他平行器血中。
注：如需要，还可以用新新鲜培养基做对照试验。
8.2.8器皿按8.2.3中所述同样条件进行培养，培养期间应符合选定方法的要求。8.2.9经过至少24h的培养后，接8.5确定细胞毒性反应。8.3直接接触试验8.3.1该试验用于细胞毒性定性和定量评价。8.3.2从持续搅拌的细胞悬液中吸取等量的悬浮液，注入与试验样品直接接触的每只器皿内。轻轻水平转动器皿，使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。8.3.3根据培养基选择含或不含5%（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养，直至培养细胞生长至近汇合。8.3.4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.3.5弃去培养器皿中的培养基，加新鲜培养基至各器皿内。8.3.6在每只器皿中央部位的细胞层上各轻轻放置一个试验样品，应确保样品覆盖细胞层表面约十分之
操作时应注意防止样品不必耍的移动，否则可能会导致细胞的物理性损伤，这可从被移动细胞的碎片来判断。
注：如可能，在细胞加入前将样品放入培养器皿内。
8.3.7同法制备阴性和阳性对照材料平行器皿。8.3.8器皿按8.3.3中所述同样条件进行培养，培养期间（最少24h）应符合选定方法的要求。8.3.9去除上层培养基，接8.5确定细胞毒性反应。8.4间接接触试验8.4.1琼脂扩散试验8.4.1.1该试验用于细胞毒性定性评价，该方法不适用于不能通过琼脂层扩散的可沥滤物或与琼脂反应的物质。8.4.1.2从持续搅样的细跑悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入每只试验用平行器皿内。轻轻水平转动器皿．使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。8.4.1.3根据培养基选择含或不含5%（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养，直至对数生长期末细胞近汇合。8.4.1.4试验前用显微检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.4.1.5弃去器皿中的培养基，然后将溶化琼脂与含血清的新鲜培养基混合，使琼脂最终质量浓度为0.5%～2%，每只器皿内加入等量的该混合液。只能使用适合于哺乳动物细胞生长的琼脂。该混合琼脂培养基应为液态，温度应适合于哺乳动物细胞。
注：各种不同分子量和纯度的琼脂可通用。
8.4.1.6将试验样品轻轻放在每只器血的固化琼脂层上，样品应覆盖细胞层表面约十分之一。吸水性材料置于琼脂之前先用培养基进行湿化处理，以防止琼脂脱水。
8.4.1.7同法制备阴性对照和阳性对照样品器皿。8.4.1.8按8.4.1.3中所述的同样条件培养24h~72h.8.4.1.9从琼脂上小心地取下样品之前、之后检测细胞毒性.。
用活体染色剂如中性红可有助于检测细胞毒性。活体染色剂可在培养前或培养后与样品一起加入．如在培养前加，应在避光条件下进行细胞培养，以防因染色剂光活化作用而引起细胞损伤。8.4.2滤膜扩散试验8.4.2.1该试验用于细胞毒性定性评价。
8.4.2.2在数只试验用培养皿内，各放置一枚孔径0.45μm、无表面活性剂的滤膜，并加入等量持续搅拌的细胞悬浮液，轻轻水平转动培养皿使细胞均匀地分散在每只滤膜的表面。
8.4.2.3根据培养基选择含或不含5%（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养，直至对数生长期末细胞近汇合。
8.4.2.4试捡前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。
8.4.2.5弃去培养皿内的培养基，将滤膜细胞面向下．放在固化的琼脂层上（见8.4.1.6）。
8.4.2.6轻经将试验样品放到滤膜无细胞面的上面．滤膜上放置不产生反应的环，用以保留提取液和新加入的成分。
8.4.2.7同法制备阴性和阳性对照样品滤膜。
8.4.2.8按8.4.2.3所述方法培养2h±10min。
8.4.2.9轻轻从滤膜上取下样品，并从琼脂面上小心分离开滤膜。
8.4.2.10采用合适的染色程序确定细胞毒性反应。
8.5细胞毒性判定
8.5.1可来用定性或定量方法检测细胞毒性。
a）定性评价：用显微镜检查细胞（如果需耍，使用细胞化学染色）评价诸如一般形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化，一般形态的改变可描述性地在试验报告中记录或以数字记录，以下是给试验材料计分的有效方法。
细胞需性计分
含义
0
无细胞毒性
1
轻微细胞毒性
2
中度细胞毒性
3
重度细胞毒性
试验报告中应包括评价方法和评价结果。
b）定量评价：测定细胞死亡、细胞生长抑制、细胞繁殖或细胞克隆形成。可以用客观的方法对细胞数量、蛋白总量、酶的释放、活体染料的释放和还原或其他可测定参数进行定量测试，使用的方法和测试结果应在试验报告中记录。
注：一些检测细胞毒性的特殊方法，可能需要零点或基线细胞培养对照。
8.5.2应慎重选择评价方法，试验样品如果释放对试验系统或对检测有影响的物质时，试验结果可能无效。
注：评价细胞活力，释放甲醛的材料须经过可靠的试验验证。
8.5.3各平行培养皿的检测结果如有显着差异，则判定试验不当或无效。8.5.4阴性、阳性及任何其他对照物（参照、培养基、空白、试剂等）在试验系统中如无预期的反应，则应重新检测。9试验报告
试验报告应详细包括以下所有内容：a）样品的描述；b）细胞系并对选择进行论证；c）培养基；d）评价方法和原理；c）浸提步骤（如必要），如可能报告沥出物质的性质和浓度；f）阴性、阳性和其他对照物；g）细胞反应和其他情况；h）结果评价所需的其他有关资料。10结果评价应由合格的专业人员根据试验数据对试验结果进行总体评价。结果如没有说服力或者无效，应重做试验。
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篇十三：聚合物的阳性对照材料
P> 医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验1范围GB/T16886的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵育；a）用器械的浸提液，和／或b）与器械接触。这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应。
2规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T16886的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，
其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验（GB/T16886.1-2001,idtISO10993-1:1997）CB/T16886.12-2000医疗器械生物学评价第12部分：样品制备和参照材料（idtISO1099312:1996）
3术语与定义GB/T16886.1/ISO1993-1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。
3.1阴性对照材料negativecontrolmaterial按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。
注：阴性对照的目的是验证背景反应，例如高密度聚乙烯1）已作为合成聚合物的阴性对照材料，氧化陶瓷棒则用作牙科材料的阴性对照物。
3.2阳性对照材料positivecontrolmaterial按照本部分试验时可重现细胞毒性反应的材料。
注：阳性对照的白目的是验证相应试验系统的反应，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯2）已用作固体材料和浸提液的阳性对照，酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。
_____________________________________1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会（Rockvillie,Maryland,USA）和Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5,Hanagawa.257-Japan）获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。2)有机锡聚氯乙烯阳性对照材料可从SIMSPortexLtd,Hythe,Kent,CT216JL,UK（产品号码499-300-000）获得。ZDEC和ZDBC聚氨甲酸乙酯可从Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5,Hanagawa257-Japan)获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。
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3)
3.3试剂对照reagentcontrol在不加试验材料的条件下，按浸提条件和试验步骤得到的浸提介质。
注：在本部分中，该定义取代GB/T16886.12/lSO10993-12中3.1给出的定义。
3.4培养器皿culturevessels适用于细胞培养的器皿，包插玻璃培养皿、塑料培养瓶或塑料多孔培养板和微量滴定板等器皿。
注，在这些试验方法中，这些器皿只要符合组织培养级别的要求，并适用于哺乳动物细胞培养．可以互换使用。
3.5近汇合subconfluency在对数生长期末，约80%的细胞汇合。
4样品制备4.1总则
供试品可选用：a）材料浸提液；和／或B）材料本身。样品制备应符合CB/T16886.12/ISO10993-12。4.2材料浸提液的制备4.2.1浸提原则为了测定潜在的毒理学危害，浸提条件应模拟或严于临床使用条件，但不应导致试验材料发生，诸如熔化、溶解或化学结构改变等明显变化。
注：浸提液中任何内源性或外源性物质的浓度及其接触试验细胞的量取决于接触面积、浸提体积、pH、化学溶解度、扩散率、溶质度、搅拌、温度、时间和其他因素。
4.2.2浸提介质哺乳动物细胞检测中应使用下列一种或几种溶剂。对浸提介质的选择应进行验证：a)含血清培养基；b)无血清培养基；c)生理盐水溶液；d)其他适宜的溶剂。
注：溶剂的选择应反映出浸提的目的，并应考虑使用极性和非极性两种溶剂。适宜的溶剂包括纯水、植物油、二甲
基亚砜（DMSO）。在所选择的测试系统中．如DMSO浓度大于0.5%（体积分数），则有细胞毒性。
4.2.3浸提条件4.2.3.1浸提应使用无菌技术，在无菌、化学惰性的封闭容器中进行，应符合GB/T16886.12/lSO10993-12的基本要求。4.2.3.2推荐的浸提条件是：
a)37℃±2℃下不少于24h；b)50℃±2℃下72h±2h；c)70℃±2℃下24h±2h；d)121℃±2℃下1h士0.2h。可根据器械特性和具体使用情况选择推荐的条件。当浸提过程使用含血清培养基时，只能来用4.2.3.2a）规定的浸提条件。
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4.2.3.3浸提液用于细胞之前，如果进行过滤、离心或其他处置方法，最终报告（见第9章）中应予以说明，对浸提液pH值的调整也应在提告中说明。对浸提撞的处理，例如对pH值的调整会影响试验结果。4.3直接接触试验材料的制备4.3.1在细胞毒性检测中，多种形状、尺寸或物理状态（即液态或固态）的材料未经修整即可进行测试。
固体样品应至少有一个平面。其他形状和物理状态的样品应进行调整。4.3.2应考虑试验样品的无菌性。4.3.2.1无菌器械试验材料的试验全过程应按无菌操作法进行。4.3.2.2试验材料如取自通常在使用前灭菌的器械，应按照制造商提供的方法灭菌，并且试验全过程应按无菌操作法进行。用于试验系统之前，制备试验材料时应考虑灭菌方法或灭菌剂对器械的影响。4.3.2.3试撞材料如取自使用中不需要灭菌的器械，则应在供应状态下使用，但在试验全过程中应按无菌操作法进行。4.3.3对液体进行试验应：a）直接附着；或b）附着到具有生物惰性和吸收性的基质上。
注：滤膜是适用的基质。
4.3.4对高吸收性材料，如果可能，试验前应用培养基将其浸透，以防吸收试验器皿中的培养基。
5细胞系5.1优先采用已建立的细胞系并应从认可的贮源获取3）5.2在需要特殊敏感性时，只能使用直接由活体组织获取的原代细胞、细胞系和器官型培养物，但需证明其反应的重现性和准确性。5.3细胞系原种培养贮存时，应放在相应培养基内，在-80℃或-80℃以下冻存，培养基内加有细胞保护剂，如二甲基亚砜或甘油等，长期贮存（几月至几年）只能在-130℃或-130℃以下冻存。5.4试验应使用无支原体污染细胞，使用前采用可靠方法检测是否存在支原体污染。
6培养基6.1培养基应无菌。6.2含血清或无血清培养基应符合选定细胞系的生长要求。
注：培养基中允许含有对试验无不利影响的抗生素。培养基的稳定性与其成分和贮存条件有关。含谷氨酰胺和血清的培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过一周，含谷氨酰胺的无血清培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过2周。6.3培养基的pH值应为7.2～7.4。7细胞原种培养制备7.1用选定的细胞系和培养基制备试验所需足够的细胞。使用冻存细胞时，如加有细胞保护剂应除去，使用前至少传代培养一次。7.2取出细胞，用适宜的酶分散法和／或机械分散法制备成细胞悬浮液。———————————————
3）推荐的细胞系如CCL1（NCTCclone929），CCL163（Balb/3T3cloneA31）、CCL171（MRC-5）、CCL75（Wl-38）、CCL81（Vero）、CCL10[BHK-21(C-l3)和V-79379A。这一信息只是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。也可使用其他能得出相同或更佳结果的细胞系。
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3
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8试验步骤8.1平行样数
至少采用三个平行试验样品数和对照数。8.2浸提液试验8.2.1该试验用于细胞毒性定性和定量评价。8.2.2从持续搅拌的细胞悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入浸提液接触的每只培养器皿内，轻轻转动培养器皿使细胞均匀地分散在器皿的表面。8.2.3根据培养基选择含或不含5%（体帜分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃士2℃温度下进行培养。
试验应在近汇合单层细胞或新鲜悬浮细胞上进行。如仅是检测克隆形成，应采用较低的细胞密度。8.2.4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.2.5试验可选用：a)浸提原液；和b)以培养基作稀释剂的系列浸提稀释液。试验如果用单层细胞，应弃去培养器皿中的培养基，在每只器皿内加等量浸提液或上述稀释液。如用悬浮细胞进行试验，细胞悬浮液制备好后立即将浸提液或上述稀稀释液加到每只平行器皿中。8.2.6采用水等非生理浸提液时，浸提液用培养基稀稀后应在最高生理相容浓度下试验。
注：建议在稀释浸提液时使用浓缩的（如2倍、5倍）培养基。
8.2.7加等量的空白试剂和阴性及阳性对照液至其他平行器血中。
注：如需要，还可以用新新鲜培养基做对照试验。
8.2.8器皿按8.2.3中所述同样条件进行培养，培养期间应符合选定方法的要求。8.2.9经过至少24h的培养后，接8.5确定细胞毒性反应。8.3直接接触试验8.3.1该试验用于细胞毒性定性和定量评价。8.3.2从持续搅拌的细胞悬液中吸取等量的悬浮液，注入与试验样品直接接触的每只器皿内。轻轻水平转动器皿，使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。8.3.3根据培养基选择含或不含5%（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养，直至培养细胞生长至近汇合。8.3.4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.3.5弃去培养器皿中的培养基，加新鲜培养基至各器皿内。8.3.6在每只器皿中央部位的细胞层上各轻轻放置一个试验样品，应确保样品覆盖细胞层表面约十分之
操作时应注意防止样品不必耍的移动，否则可能会导致细胞的物理性损伤，这可从被移动细胞的碎片来判断。
注：如可能，在细胞加入前将样品放入培养器皿内。
8.3.7同法制备阴性和阳性对照材料平行器皿。8.3.8器皿按8.3.3中所述同样条件进行培养，培养期间（最少24h）应符合选定方法的要求。8.3.9去除上层培养基，接8.5确定细胞毒性反应。8.4间接接触试验8.4.1琼脂扩散试验8.4.1.1该试验用于细胞毒性定性评价，该方法不适用于不能通过琼脂层扩散的可沥滤物或与琼脂反应的物质。
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4
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8.4.1.2从持续搅样的细跑悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入每只试验用平行器皿内。轻轻水平转动器
皿．使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。
8.4.1.3根据培养基选择含或不含5%（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进
行培养，直至对数生长期末细胞近汇合。
8.4.1.4试验前用显微检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.4.1.5弃去器皿中的培养基，然后将溶化琼脂与含血清的新鲜培养基混合，使琼脂最终质量浓度为
0.5%～2%，每只器皿内加入等量的该混合液。只能使用适合于哺乳动物细胞生长的琼脂。该混合琼脂培
养基应为液态，温度应适合于哺乳动物细胞。
注：各种不同分子量和纯度的琼脂可通用。
8.4.1.6将试验样品轻轻放在每只器血的固化琼脂层上，样品应覆盖细胞层表面约十分之一。
吸水性材料置于琼脂之前先用培养基进行湿化处理，以防止琼脂脱水。
8.4.1.7同法制备阴性对照和阳性对照样品器皿。
8.4.1.8按8.4.1.3中所述的同样条件培养24h~72h.
8.4.1.9从琼脂上小心地取下样品之前、之后检测细胞毒性.。
用活体染色剂如中性红可有助于检测细胞毒性。活体染色剂可在培养前或培养后与样品一起加入．如
在培养前加，应在避光条件下进行细胞培养，以防因染色剂光活化作用而引起细胞损伤。
8.4.2滤膜扩散试验
8.4.2.1该试验用于细胞毒性定性评价。
8.4.2.2在数只试验用培养皿内，各放置一枚孔径0.45μm、无表面活性剂的滤膜，并加入等量持续搅拌
的细胞悬浮液，轻轻水平转动培养皿使细胞均匀地分散在每只滤膜的表面。
8.4.2.3根据培养基选择含或不含5%（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进
行培养，直至对数生长期末细胞近汇合。
8.4.2.4试捡前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。
8.4.2.5弃去培养皿内的培养基，将滤膜细胞面向下．放在固化的琼脂层上（见8.4.1.6）。
8.4.2.6轻经将试验样品放到滤膜无细胞面的上面．滤膜上放置不产生反应的环，用以保留提取液和新加
入的成分。
8.4.2.7同法制备阴性和阳性对照样品滤膜。
8.4.2.8按8.4.2.3所述方法培养2h±10min。
8.4.2.9轻轻从滤膜上取下样品，并从琼脂面上小心分离开滤膜。
8.4.2.10采用合适的染色程序确定细胞毒性反应。
8.5细胞毒性判定
8.5.1可来用定性或定量方法检测细胞毒性。
a）定性评价：用显微镜检查细胞（如果需耍，使用细胞化学染色）评价诸如一般形态、空泡形成、
脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化，一般形态的改变可描述性地在试验报告中记录或以数字记录，
以下是给试验材料计分的有效方法。
细胞需性计分
含义
0
无细胞毒性
1
轻微细胞毒性
2
中度细胞毒性
3
重度细胞毒性
试验报告中应包括评价方法和评价结果。
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5
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b）定量评价：测定细胞死亡、细胞生长抑制、细胞繁殖或细胞克隆形成。可以用客观的方法对细胞数量、蛋白总量、酶的释放、活体染料的释放和还原或其他可测定参数进行定量测试，使用的方法和测试结果应在试验报告中记录。
注：一些检测细胞毒性的特殊方法，可能需要零点或基线细胞培养对照。
8.5.2应慎重选择评价方法，试验样品如果释放对试验系统或对检测有影响的物质时，试验结果可能无效。
注：评价细胞活力，释放甲醛的材料须经过可靠的试验验证。
8.5.3各平行培养皿的检测结果如有显著差异，则判定试验不当或无效。8.5.4阴性、阳性及任何其他对照物（参照、培养基、空白、试剂等）在试验系统中如无预期的反应，则应重新检测。9试验报告
试验报告应详细包括以下所有内容：a）样品的描述；b）细胞系并对选择进行论证；c）培养基；d）评价方法和原理；c）浸提步骤（如必要），如可能报告沥出物质的性质和浓度；f）阴性、阳性和其他对照物；g）细胞反应和其他情况；h）结果评价所需的其他有关资料。10结果评价应由合格的专业人员根据试验数据对试验结果进行总体评价。结果如没有说服力或者无效，应重做试验。
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篇十四：聚合物的阳性对照材料
P> 技术标准DVGWW270(2007.11版)
与饮用水接触材料的微生物强化控制—测试与评定
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目录
前言…………………………………………………………………………………………………40介绍……………………………………………………………………………………………41范围……………………………………………………………………………………………52参考标准………………………………………………………………………………………53定义……………………………………………………………………………………………53.1现场产品……………………………………………………………………………………53.2生物膜………………………………………………………………………………………53.3阴性对照……………………………………………………………………………………53.4外表移殖……………………………………………………………………………………53.5单位外表生物增长量………………………………………………………………………53.6阳性对照……………………………………………………………………………………63.7测试样品……………………………………………………………………………………63.8产品…………………………………………………………………………………………63.9测试样………………………………………………………………………………………63.10测试用水……………………………………………………………………………………63.11饮用水………………………………………………………………………………………63.12工厂制造之产品……………………………………………………………………………63.13复合材料……………………………………………………………………………………63.14材料…………………………………………………………………………………………64原理……………………………………………………………………………………………65根本要求………………………………………………………………………………………65.1通那么…………………………………………………………………………………………
65.2参考材料……………………………………………………………………………………76仪器和试剂……………………………………………………………………………………76.1供测试管道和软管的测试容器和测试方法………………………………………………76.2刮刀…………………………………………………………………………………………76.3离心机………………………………………………………………………………………76.4离心别离用的玻璃器皿……………………………………………………………………76.5流量计………………………………………………………………………………………76.6试剂…………………………………………………………………………………………7
消毒剂……………………………………………………………………………………7测试用水…………………………………………………………………………………7阳性对照…………………………………………………………………………………8阴性对照…………………………………………………………………………………87测试样品之准备和预处理……………………………………………………………………87.1测试样品……………………………………………………………………………………87.2测试样品的预处理…………………………………………………………………………87.3管道和软管测试容器或测试方法的准备…………………………………………………88测试程序………………………………………………………………………………………88.1通那么…………………………………………………………………………………………
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8.2测试样品的转移……………………………………………………………………………98.3测试样的测试………………………………………………………………………………98.4收取后之再暴露实验………………………………………………………………………98.5别离和外表生物增长量测定………………………………………………………………98.6外表生物增长量的测试……………………………………………………………………98.7测试周期………………………………………………………………………………………99估值与评定……………………………………………………………………………………109.1符合要求的实验结果评估…………………………………………………………………109.2评定…………………………………………………………………………………………11
通那么………………………………………………………………………………………11评定〔无非强制测试的每月测试数据〕………………………………………………11非强制性每月测试数据之评定…………………………………………………………12.1通那么……………………………………………………………………………………12.2具有较大外表积的接头和垫片〔D1〕…………………………………………………12.3具有较小外表积的接头和垫片〔D2〕………………………………………………1210测试报告和检验证书……………………………………………………….………………1310.1测试报告细节……………………………………………………………………………1310.2检验证书…………………………………………………………………………………1410.3检验证书的有效期限……………………………………………………………………1511对于检验机构的要求………………………………………………………………………15附录A〔标准〕：对于DVGWW270之国家临时性约定…………………………………………16附录B〔提供之信息〕…………………………………………………………………………16
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前言
此标准由“水质量〞技术委员会内部之DVGW-AD“物质中微生物的强化控制〞组修订。其中描述了对与饮用水接触的材料的微生物强化控制测试。
如果与饮用水接触的材料是有机物质或者包含有机物质，低分子量的有机物外表将为生存细菌，由此进入饮用水系统。
此标准最初是在1984年开场执行的。到那时为止，有机物的测试和评估仅仅根据其对水产生的卫生清洁和生理特性判断。没有执行有关微生物学行为方面的判定。此标准提供了对试实际生活中的材料进展微生物测试的方法。此标准的目的就是为水公用事业单位、公司、消费者提供一个对与水接触材料进展微生物测试评估的一种选择，以确保供水系统中饮用水对消费者的平安。
此修订版之标准是基于99年11月份版本有三个方面的提升：a)消减了半年时间的测试期，该时间阻碍了更好的新材料的开展。b)提升了测试程序的准确度。c)800cm^2的测定限值，这个限值到目前为止仍然是评估限值。
不包含有关材料物理的、化学的、技术上的和毒性原理上的行为的附加信息。同时也不囊括和水接触物质的稳定性、清洁度、感染试剂等方面的测试方法。
当前之版本代替DVGW-标准W270，1999年11月版使用。
修改
比照DVGW-标准W270，1999年11月版，有如下修改：a)测试期的改变。b)外表单位生物量的测定量的改变。c)限值的改变。
之前版本
DVGWW270:1984-01DVGWW270:1990-12DVGWW270:1999-11
0介绍
为了排除微生物对饮用水的影响，在这个区域，只有那些不会和饮用水接触引发微生物衍生的物质可以使用。
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微生物滋生于所有潮湿物体外表。这些微生物的滋生对饮用水有影响。但是，如果被用于微生物测试的有机物质，材料测试可以使用单位外表生物量来计量微生物衍生程度。这种情况由于这种情况下，其可以成为病菌或在潜在病菌的栖息地，因此是不能承受的。
1范围
此标准描述了测定有机物质中微生物成长量和材质包含的有机物成分，以此预测饮用水或者准饮用水之水质。
这种方法可以应用于以下材料：●〔工厂生产的〕成品，比方管件。●现场〔产品之生产现场〕，比方涂层。
由于有关测试过程的技术困难性，这种方法不适用用于油脂和油类物质。如果材料不含有机物质局部，这个测试是不必要的。只要材料中含有有机成分，测试都必须执行。
2参考标准
这个标准包含来自其他出版物的有日期和无日期的参考指示、规定。这些参考标准将会在测试过程中适宜位置引述，并将标准随后附列。
对于有日期之参考、随后的修改、修订，只有当其包含在修订或者修正版标准中才可以使用。
对于无日期标注的参考，仅最新版可以使用。
3定义
3.1现场产品
在生产现场的成品或者在产产品〔半成品〕，比方涂层。
3.2生物膜
通用的生物衍生面状物，其外表可以测试与饮用水接触之材料单位滋生生物量。
3.3阴性对照
薄片状测试样，都是用可重复制造之材料构成，而不会出现外表生物量增长。
3.4外表移殖
只要材料不包含生物灭杀剂的有效成分，与饮用水接触的任何外表都会有生物产生。外表衍生物将可以通过接触培植，置换以及其他微生物测试程序进展检测。
3.5单位外表生物增长量
存在于与饮用水接触的材质外表生物量，可以通过刮擦移除。外表生物量包含有机微生
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物〔活的和死了的细胞〕以及细胞外的聚合物。
3.6阳性对照
薄片状测试样，都是用可重复制造的材料，并将有利于外表生物滋生的有机降解物质散布于其表层。
3.7测试样品
用于测试的材料或产品的所有测试局部。
3.8产品
用于预测在饮用水再生、处理或者分销过程中与水接触的，由一种或者多种材料制成的组件。
3.9测试样
用于测试的〔最好是薄片〕组件。测试样一般情况下是产品或者产品的局部〔比方复合管〕。
3.10测试用水
饮用水质量级别的用于测试的水样。〔不含氯或者其他消毒剂。〕
3.11饮用水
符合饮用水法令要求规定的用于人类饮用的水。
3.12工厂制造之产品
在控制条件下由工厂生产的产品。
3.13复合材料
由多种材料构成，且其外表与水接触对水可能产生影响的物质。
3.14材料
材料就是可以用其在既定的方法和生产方式下生产出产品的部件。
4原理
测试样用消毒剂消毒，并用饮用水冲洗，裸放于水流缓慢流动的测试容器内。在规定的时间内将测试样移走，擦掉水，通过刮擦将外表滋生之生物获取，通过离心过滤将生物量定量。
5根本要求
5.1通那么
测试样应该在成分、处理或者成品之性能等方面应具有代表性。不建议测试未生产前准备产品。复合产品〔如复合管道、软管和涂层〕可以根据此标准当做产品进展测试。
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化学复合物和产品代码或者材料的品牌名称应该在测试开场前以密件呈递给负责测试的机构。材料的组成应符合国家规定并且被测试实验室认可。
样品的生产应和成品生产一样。如果不可能，那么生产商应该确保样品的性能和生产产品之性能保持一致。生产方法和未来之保养方法应提供应测试机构。
样品应该有特别标识注明。
5.2参考材料
为了确保测试过程之延续性，有必要引入并使带有指定的微生物行为的材料齐全。在测试期间，阳性对照组必须运用可降解之物质以使得生存微生物，同时阴性对照组仅仅使用受外表衍生〔才能产生微生物〕的物质。
6仪器和试剂
6.1供测试管道和软管的测试容器和测试方法
测试容器，盖子，挂钩以及其他在容器中放置测试样品的装置，还有引水用的管道等全部设备必须用不会生存微生物的材料制成〔不锈钢，玻璃〕。测试皿的容量大概为100升。水流入口应该在底部，流出部位应该在流入口对面之上部。
管道和软管之测试方法统一用一种方法，样品管被安装在一个垂直从底部流向顶部的受控流道中。在静力环境下水流通过固定的溢流装置从可移动小容器中流出〔就像管体式水塔〕。
6.2刮刀
刮刀带一个橡胶盖〔如窗户清洁器〕或者用硬塑料制成，宽度12-15厘米。管道或者软管的相关适宜尺寸的锥形塞子固定在一个不锈钢杆子上，塞子用硅胶或者硬聚氯乙烯制成。
6.3离心机
离心机带有一个摆动式旋转器，重力加速度至少在3000xg。
6.4离心别离用的玻璃器皿
0.4毫升，刻度精度为0.01毫升〔见图1〕。预期之外表生物量最好为0.5毫升〔阳性对照组〕，锥形离心试管之容量建议为15毫升〔见〕。
6.5流量计
液体流量计直流流速范围是2升到25升/小时。
6.6试剂
消毒剂根据标准EN901规定制成的次氯酸钠溶液，应包含10±1g/l游离态氯。
测试用水
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测试用水不应该包含任何有抑制生物增长的物质〔比方氯气，二氧化氯〕〔见3.10〕。温度范围为12±5℃。
阳性对照阳性对照实验应该在薄片〔外表积不少于800平方厘米〕上进展，其材料是用微生物惰
性材料制成〔玻璃或者不锈钢〕，测试外表的一边用石蜡〔熔点是56-58℃，MERCK号7337，或者类似产品〕涂封。
阴性对照阴性对照实验应该在薄片〔外表积不少于800平方厘米〕上进展，其材料是用微生物惰
性材料制成〔玻璃或者不锈钢〕。
7测试样品之准备和预处理
7.1测试样品
作为测试材料用的测试样必须〔通常〕是做成薄片。在一些特殊情况下，成品或者成品之局部被用于测试实验〔见第三章〕。对于每个暴露时间下，最少一个试样是用于阴阳对照实验，也就是两个测试样会被测试。所有测试样品外表积有800平方厘米，常用尺寸应该为20cmX20cmX。
7.2测试样的预处理
在第一次浸入测试容器前，所有阴阳对照组测试样品应该在测试水流中冲洗20±1小时。随后所有阴阳对照实验测试样用次氯酸钠溶液消毒30±5分钟，并用测试水冲洗2分钟。当下述描述的程序执行完后的所有暴露实验，将不再包含新的预处理程序。
7.3管道和软管测试容器或测试方法的准备
在使用测试容器进展测试前，必须用测试水清洗容器，清洗时间为30±5分钟。然后用测试水装满测试容器，并使得测试水流维持在20±2升/小时通过测试容器。
管道和软管测试方法中的直流应该保持在/h到3m/h，以防止对生物膜产生切变力。
8测试程序
8.1通那么
测试样应该在预处理完成后〔见7.2〕安装入已经准备好的测试容器中〔见7.3〕。在每个测试容器中至少应该各安装一个阴阳对照组。
在每个测试容器中，不同的测试样都可以暴露〔不遮蔽〕。测试样可以用钩子悬挂或者各自用一个设备固定安装在容器底部。测试样的外表在任何情况下都要以一样程度地结接触水流，并且不能相互接触。
在每个测试期间，测试样被浸入测试容器和取出〔见8.2〕，执行以下操作要求：●测试样必须在测试期间处于黑暗中〔不能见光〕。●测试样应完全浸入测试容器中。
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●测试容器中测试水流量应长久不变维持在20±2升/小时。
●测试温度应该为12±5℃。
●测试样除非用于评估，否那么不得从测试容器中取出〔见8.2〕。
只要管道和软管被测试，管道和软管将被垂直安装于一个由下到上的受控直流的流道中。
8.2测试样品的转移
在从实验容器中取出阴阳性对照试样前，如果必要，应撇取水面漂浮层，并移除。将阴阳对照实验用的管道和软管从测试容器或者测试模块中取出〔用不锈钢钩子或者镊子〕。不要接触测试外表。
让阴阳对照组测试样上的水自动下淋1±0.5分钟。
测试样的测试
微生物〔外表微生物增长〕用刮刀从管道和软管的锥形塞子撒花姑娘取出，并全部放到玻璃仪器中供别离。
对于没有可识别的微生物滋生之样品，将执行接触培植/交换程序：
富有营养的琼脂〔根据DWD测试程序描述〕和培养真菌用的沙保罗式琼脂培养基〔MERCK号7662,或者等同/类似物质〕。在20℃下，接触培植要孵化2天时间，沙保罗式琼脂培养基需要5天。
收取后之再暴露实验
当测试期间阴阳对照组的测试样收刮用饮用水冲洗后，外表微生物应该无残留。之后，测试样被重新浸入测试容器进展第二阶段测试，或者进展第二阶段测试安排。
8.5别离和外表生物增长量测定
转入玻璃管中的微生物将通过离心机别离浓缩，在重力加速度3000xg情况下别离10分钟，或者在重力加速度4000xg下别离5分钟。在实验报告上记录微生物的颜色和浓度。
从离心机上的玻璃刻度读出外表微生物的量。
8.6外表滋生生物量的测试
当实验不能明确地获得从外表刮擦到的微生物或者可能的无机物〔沉积矿物质〕的时候，将进一步进展调查〔实验〕。
8.7测试周期
每份材料或产品都必须经过几次测试。这些测试周期在同一时间开场。每个测试周期包含阳性对照和阴性对照实验。
每月一测试
测试样〔2x800平方厘米平行样，见7.1〕和阴性阳性对照暴露4周时间，然后按照8.2和8.3程序转移和测试。然后再暴露4周时间。这个程序重复3次〔3x4周〕，或者4次〔4x4周〕停顿〔测试1a,1b,1c和选择测试1d〕。
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隔月一测试
测试样〔2x800平方厘米平行样，见7.1〕和阴性阳性对照按照每月一测试样品一样处理，预期暴露期为8周。这个程序重复实验，暴露测试一个周期〔1x8周〕或者选择测试2个周期(2x8周)后完成〔测试2a,选择测试2b〕。
三月一测试
测试样〔2x800平方厘米平行样，见7.1〕和阴性阳性对照暴露12周时间，然后按照8.2和8.3程序转移和测试〔测试3a〕。
暴露时间按照表格1方案安排。
表格1：暴露时间和测试周期
每期延续时测试样数量
间说明
4周后
8周后
12周后
选择测试〔非强制〕16周后
2x800平方厘米外表每月一次测〔连同阳性试〔4周收刮〕和阴性对照各1个〕
微生物收刮〔平均=1a结果〕
毫升/阳性对照毫升/阴性对照
微生物收刮〔平均=1b结
果〕毫升/阳性对照毫升/阴性对照
微生物收刮〔平均=1c结
果〕毫升/阳性对照毫升/阴性对照
微生物收刮〔平均=1d结
果〕毫升/阳性对照毫升/阴性对照
暴露开场时间〔0点〕
2x800平方每二月一次厘米外表测试〔8周收〔连同阳性
刮〕和阴性对照各1个〕
微生物收刮〔平均=2a结
果〕毫升/阳性对照毫升/阴性对照
微生物收刮〔平均=2b结
果〕毫升/阳性对照毫升/阴性对照
2x800平方每三月一次厘米外表测试〔12周收〔连同阳性
刮〕和阴性对照各1个〕
微生物收刮〔平均=3a结
果〕毫升/阳性对照毫升/阴性对照
9估值和评定
9.1符合要求的实验结果评估
只有当测试程序本身符合要求才可能对实验材料进展评估和鉴定。如果下述情况符合，这就可以执行评估与鉴定程序。●阳性测试组外表微生物增长量〔以及上述提及的石蜡至少需要1.5毫升/800平方厘米〕
见8.5。●阴性测试组无外表微生物增长量〔小于0.01毫升/800平方厘米〕，但是通过接触培植/
交换获得的微生物移殖量应该是可测的。
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如果测试结果不符合要求，那么将需要重新准备整个测试过程中包含阴性阳性对照实验所需要的新测试样品。
9.2评定
通那么材料的评定依据是材料外表微生物增长量。在每个测试过程中，2x800平方厘米的测试
材料上的微生物将被收刮。从每个测试周期中的平行测试结果中可以计算出算术平均值。这些平均值是评定的根底。分析过程中的检测精度是0.01毫升/800平方厘米。检测期间的数据保存2位小数点。
评定〔无非强制测试的每月测试数据〕根据如下描述评定材料〔同时见表2〕
a)测试期间仅在外表微生物衍生量〔比拟接触培植/置换和阴性对照测试样〕或者外表微生物增长量上小于±的材料符合该标准要求，从微生物方面来看，可以用于与饮用水接触的〔管道〕系统。
b)±的材料，不符合该标准要求，不能应用于饮用水领域。c)对于使用于比拟大的接头和垫片〔D1类〕的材料，其限值是±。除了第一个每月测试期
〔1a〕±/800平方厘米是不能承受的。另外，测试结果数值(包括偏差)应表现出相等或者下降趋势，比方1c的值应该小于等于1b的值，3a的值小于等于2a的值〔见表2〕。d)对于使用于较小的外表的接头和垫片〔D2类〕的材料±0.03毫升/800平方厘米。除了第一个每月测试期〔1a〕±0.03毫升/800平方厘米是不能承受的。另外，测试结果数值(包括公差)应表现出相等或者下降趋势，比方1c的值应该小于等于1b的值，3a的值小于等于2a的值〔见表2〕。e)对于外表微生物增长量或者外表微生物移殖量不符合该标准要求的材料均不能用于饮用水接触系统。
表2：评定一览表，不含非强制测试值〔〕
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每月一次测试
每二月一次测试
每三月一次测试
材料测试使用范围
测试结果〔平测试结果〔平测试结果〔平测试结果〔平
测试结果〔平均〕1a
均〕1b
均〕1c
均〕2a
均〕3a
与饮用水接触的通用材料〔无限
制〕
所有测试结果≤±
用于较大的接头和垫片的与水接触的材料。(D1)
如果1a≥1b，1a将不被用于评定。〔如果1a比1b要明显低，见“非
强制月度测试值〞)
所有测试结果〔平均值〕≤±，并且1c≤1b,3a≤2a
用于较小外表的垫片和接头的与
水接触的材料〔D2)
如果1a≥1b，1a将不被用于评定。〔如果1a比1b要明显低，见“非
强制月度测试值〞)
所有测试结果〔平均值〕≤±0.03毫升/800平方厘米，并且1c≤1b,3a≤2a
非强制性每月测试数据之评定
.1通那么
非强制性测试结果仅当D1，D2范围内的材料在第一次每月测试结果小于限值并且第二次每月测试结果〔1b)高于限值〔见表3〕时，可用于评估。除了非强制性每月实验结果外，第四次每月测试结果(1d)和第二次每二月测试结果〔2b〕可用于测定和评估。因此，第一次每月测试结果〔1a〕无效。这些试验中从第二次每月测试结果开场可以评定材料了〔见表3〕。
.2具有较大外表积的接头和垫片(D1)
除了第二次每月测试结果〔1b〕应≤±0.03毫升/800平方厘米。另外，测试结果〔在公差范围内〕必须有平行或者下降趋势，比方1d≤1c,2b≤2a,3a≤2a(见表3)。
.3具有较小外表积的接头和垫片〔D2〕
除了第二次每月测试结果〔1b〕应≤±0.03毫升/800平方厘米。另外，测试结果〔在公差范围内〕必须有平行或者下降趋势，比方1d≤1c,2b≤2a,3a≤2a(见表3)。
表3：评定一览表，应用于非强制测试值〔〕
每月一次测试
每2月一次测试
每三月
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一次测试
材料测试使测试结果〔平测试结果〔平测试结果测试结果测试结果测试结果测试结果
用范围
均〕1a
均〕1b〔平均〕1c〔平均〕1d〔平均〕2a〔平均〕2b〔平均〕3a
用于较大的接头和垫片的与水接触
的材料(D1)。
1a比1b要明显低并且1a低于限值。
如果1b≥1c，1b将不被用于评定。
所有测试结果〔平均值〕≤±0.03毫升/800平方厘米，并且1d≤1c,2b≤2a,3a≤2a
用于较小外表的垫片和接头的与水接触的材料
(D2)。
1a比1b要明显低并且1a低于限值。
如果1b≥1c，1b将不被用于评定。
所有测试结果〔平均值〕≤±0.03毫升/800平方厘米，并且1d≤1c,2b≤2a,3a≤2a
10测试报告和检验证书
10.1测试报告细节
测试结果和得出的评价将写入测试报告中。另外，测试报告将至少包含如下数据：●检测报告●根据DVGWW270〔2007.11版〕标准之测试●材料/产品描述
材料/产品名称〔品牌名称〕制造商组合信息〔递交的，评估的和认证的信息〕生产方式〔现行的/外来的〕使用范围〔管道/配件/接头，垫片〕●测试样品/测试件种类和性质生产情况预处理和维护〔如果可用〕储藏条件〔在生产和测试期之间，如果可用〕●测试结果〔见表4〕
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●额外发现〔结果〕●评定〔备注，判断在正确的生产条件下生产的材料是否可以在与饮用水接触的范围内使
用。〕●关于测试证书的用途用于出版或用于公共关系之目的的有关限制说明。
表4：在测试报告中显示的测试结果
延续时间
4周后
8周后
12周后
选择〔非强制性〕测试：16周
后
每月一次测试
…毫升第一套….毫升第二套
平均值1a…毫升阳性对照
….阴性对照
…毫升第一套….毫升第二套
平均值1b…毫升阳性对
照….阴性对照
…毫升第一套….毫升第二套
平均值1c…毫升阳性对照
….阴性对照
…毫升第一套….毫升第二套
平均值1d…毫升阳性对
照….阴性对照
暴露开场时间〔0点〕
每二月一次测试
…毫升第一套….毫升第二套
平均值2a…毫升阳性对
照….阴性对照
…毫升第一套….毫升第二套
平均值2b…毫升阳性对
照….阴性对照
每三月一次测试
…毫升第一套….毫升第二套
平均值3a…毫升阳性对照
….阴性对照
10.2检验证书
当通过该标准下的测试后，除了测试报告外，将会颁发测试材料或产品的检测证书。另外该证书至少应包含以下信息：●检测证书●根据DVGWW270〔2007.11版〕之测试●额外延展期：声明有效期：●检测机构●检测日期●检测编号/内部参考编号
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●制造商和品牌名称●材料/产品描述●使用范围〔管道/配件/接头，垫片〕●评定〔备注，判断在正确的生产条件下生产的材料是否可以在与饮用水接触的范围内使
用。〕●关于测试证书的用途用于出版或用于公共关系之目的的有关限制说明。●备注：仅当测试样品之化学组成或者生产方式没有变化的情况下，检测证书有效。
10.3检验证书的有效期限
如果化学成分和生产方式无变化，那么检测证书有效期是5年。如果化学成分和生产方式无变化，那么可以不用进一步进展测试〔根据DVGWW270标准〕，检测证书的有效期可以延长至下一个5年期。生产商应该就此写一份书面声明，提交给检测机构。检测报告的有效期之延展应在检测证书中标注。
11对于检测机构的要求
根据此标准下的检测事项应该在DVGWW270认可的检测机构进展。此外，检测机构应该获得分支机构之认可承受〔如DVGW〕。
附录A〔标准〕：对于DVGWW270之国家临时性约定〔无〕
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附录B〔提供之信息〕
表面微生物增长量毫升/800平方厘米
暴露时间
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
1
2
3
月度
图表B1：符合DVGWW270标准要求的与饮用水接触的通用材料测试结果例如绿色线：升/800平方厘米黄色线：
表面微生物增长量毫升/800平方厘米
暴露时间
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
1
2
3
月度
图表B2：符合DVGWW270标准要求的与饮用水接触的材料D1，D2测试结果例如
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表面微生物增长量毫升/800平方厘米
暴露时间
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
1
2
3
月度
图表B3：不符合DVGWW270标准要求的与饮用水接触的材料测试结果例如
表面微生物增长量毫升/800平方厘米
暴露时间
0.250.2
0.15
0.1
0.05
0
1
2
3
4
月度
图表B4：应用非强制性月度测试评估的符合DVGWW270标准要求的与饮用水接触的D1，D2材料测试结果例如
0平方厘米蓝色点：可选择〔非强制〕月度实验结果
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篇十五：聚合物的阳性对照材料
P> GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验
1范围GB/T16886的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵育；a）用器械的浸提液，和／或b）与器械接触。这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应。
2规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T16886的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，
其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验（GB/T16886.1-2001,idtISO10993-1:1997）CB/T16886.12-2000医疗器械生物学评价第12部分：样品制备和参照材料（idtISO1099312:1996）
3术语与定义GB/T16886.1/ISO1993-1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。
3.1阴性对照材料negativecontrolmaterial按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。
注：阴性对照的目的是验证背景反应，例如高密度聚乙烯1）已作为合成聚合物的阴性对照材料，氧化陶瓷棒则用作牙科材料的阴性对照物。
3.2阳性对照材料positivecontrolmaterial按照本部分试验时可重现细胞毒性反应的材料。
注：阳性对照的白目的是验证相应试验系统的反应，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯2）已用作固体材料和浸提液的阳性对照，酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。
_____________________________________1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会（Rockvillie,Maryland,USA）和Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5,Hanagawa.257-Japan）获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。2)有机锡聚氯乙烯阳性对照材料可从SIMSPortexLtd,Hythe,Kent,CT216JL,UK（产品号码499-300-000）获得。ZDEC和ZDBC聚氨甲酸乙酯可从Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5,Hanagawa257-Japan)获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999
3.3试剂对照reagentcontrol在不加试验材料的条件下，按浸提条件和试验步骤得到的浸提介质。
注：在本部分中，该定义取代GB/T16886.12/lSO10993-12中3.1给出的定义。
3.4培养器皿culturevessels适用于细胞培养的器皿，包插玻璃培养皿、塑料培养瓶或塑料多孔培养板和微量滴定板等器皿。
注，在这些试验方法中，这些器皿只要符合组织培养级别的要求，并适用于哺乳动物细胞培养．可以互换使用。
3.5近汇合subconfluency在对数生长期末，约80%的细胞汇合。
4样品制备4.1总则
供试品可选用：a）材料浸提液；和／或B）材料本身。样品制备应符合CB/T16886.12/ISO10993-12。4.2材料浸提液的制备4.2.1浸提原则为了测定潜在的毒理学危害，浸提条件应模拟或严于临床使用条件，但不应导致试验材料发生，诸如熔化、溶解或化学结构改变等明显变化。
注：浸提液中任何内源性或外源性物质的浓度及其接触试验细胞的量取决于接触面积、浸提体积、pH、化学溶解度、扩散率、溶质度、搅拌、温度、时间和其他因素。
4.2.2浸提介质哺乳动物细胞检测中应使用下列一种或几种溶剂。对浸提介质的选择应进行验证：a)含血清培养基；b)无血清培养基；c)生理盐水溶液；d)其他适宜的溶剂。
注：溶剂的选择应反映出浸提的目的，并应考虑使用极性和非极性两种溶剂。适宜的溶剂包括纯水、植物油、二甲基亚砜（DMSO）。在所选择的测试系统中．如DMSO浓度大于0.5%（体积分数），则有细胞毒性。
4.2.3浸提条件4.2.3.1浸提应使用无菌技术，在无菌、化学惰性的封闭容器中进行，应符合GB/T16886.12/lSO10993-12的基本要求。4.2.3.2推荐的浸提条件是：
a)37℃±2℃下不少于24h；b)50℃±2℃下72h±2h；c)70℃±2℃下24h±2h；d)121℃±2℃下1h士0.2h。可根据器械特性和具体使用情况选择推荐的条件。当浸提过程使用含血清培养基时，只能来用4.2.3.2a）规定的浸提条件。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999
4.2.3.3浸提液用于细胞之前，如果进行过滤、离心或其他处置方法，最终报告（见第9章）中应予以说明，对浸提液pH值的调整也应在提告中说明。对浸提撞的处理，例如对pH值的调整会影响试验结果。4.3直接接触试验材料的制备4.3.1在细胞毒性检测中，多种形状、尺寸或物理状态（即液态或固态）的材料未经修整即可进行测试。
固体样品应至少有一个平面。其他形状和物理状态的样品应进行调整。4.3.2应考虑试验样品的无菌性。4.3.2.1无菌器械试验材料的试验全过程应按无菌操作法进行。4.3.2.2试验材料如取自通常在使用前灭菌的器械，应按照制造商提供的方法灭菌，并且试验全过程应按无菌操作法进行。用于试验系统之前，制备试验材料时应考虑灭菌方法或灭菌剂对器械的影响。4.3.2.3试撞材料如取自使用中不需要灭菌的器械，则应在供应状态下使用，但在试验全过程中应按无菌操作法进行。4.3.3对液体进行试验应：a）直接附着；或b）附着到具有生物惰性和吸收性的基质上。
注：滤膜是适用的基质。
4.3.4对高吸收性材料，如果可能，试验前应用培养基将其浸透，以防吸收试验器皿中的培养基。
5细胞系5.1优先采用已建立的细胞系并应从认可的贮源获取3）5.2在需要特殊敏感性时，只能使用直接由活体组织获取的原代细胞、细胞系和器官型培养物，但需证明其反应的重现性和准确性。5.3细胞系原种培养贮存时，应放在相应培养基内，在-80℃或-80℃以下冻存，培养基内加有细胞保护剂，如二甲基亚砜或甘油等，长期贮存（几月至几年）只能在-130℃或-130℃以下冻存。5.4试验应使用无支原体污染细胞，使用前采用可靠方法检测是否存在支原体污染。
6培养基6.1培养基应无菌。6.2含血清或无血清培养基应符合选定细胞系的生长要求。
注：培养基中允许含有对试验无不利影响的抗生素。培养基的稳定性与其成分和贮存条件有关。含谷氨酰胺和血清的培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过一周，含谷氨酰胺的无血清培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过2周。6.3培养基的pH值应为7.2～7.4。7细胞原种培养制备7.1用选定的细胞系和培养基制备试验所需足够的细胞。使用冻存细胞时，如加有细胞保护剂应除去，使用前至少传代培养一次。7.2取出细胞，用适宜的酶分散法和／或机械分散法制备成细胞悬浮液。———————————————
3）推荐的细胞系如CCL1（NCTCclone929），CCL163（Balb/3T3cloneA31）、CCL171（MRC-5）、CCL75（Wl-38）、CCL81（Vero）、CCL10[BHK-21(C-l3)和V-79379A。这一信息只是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。也可使用其他能得出相同或更佳结果的细胞系。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999
8试验步骤8.1平行样数
至少采用三个平行试验样品数和对照数。8.2浸提液试验8.2.1该试验用于细胞毒性定性和定量评价。8.2.2从持续搅拌的细胞悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入浸提液接触的每只培养器皿内，轻轻转动培养器皿使细胞均匀地分散在器皿的表面。8.2.3根据培养基选择含或不含5%（体帜分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃士2℃温度下进行培养。
试验应在近汇合单层细胞或新鲜悬浮细胞上进行。如仅是检测克隆形成，应采用较低的细胞密度。8.2.4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.2.5试验可选用：a)浸提原液；和b)以培养基作稀释剂的系列浸提稀释液。试验如果用单层细胞，应弃去培养器皿中的培养基，在每只器皿内加等量浸提液或上述稀释液。如用悬浮细胞进行试验，细胞悬浮液制备好后立即将浸提液或上述稀稀释液加到每只平行器皿中。8.2.6采用水等非生理浸提液时，浸提液用培养基稀稀后应在最高生理相容浓度下试验。
注：建议在稀释浸提液时使用浓缩的（如2倍、5倍）培养基。
8.2.7加等量的空白试剂和阴性及阳性对照液至其他平行器血中。
注：如需要，还可以用新新鲜培养基做对照试验。
8.2.8器皿按8.2.3中所述同样条件进行培养，培养期间应符合选定方法的要求。8.2.9经过至少24h的培养后，接8.5确定细胞毒性反应。8.3直接接触试验8.3.1该试验用于细胞毒性定性和定量评价。8.3.2从持续搅拌的细胞悬液中吸取等量的悬浮液，注入与试验样品直接接触的每只器皿内。轻轻水平转动器皿，使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。8.3.3根据培养基选择含或不含5%（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养，直至培养细胞生长至近汇合。8.3.4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.3.5弃去培养器皿中的培养基，加新鲜培养基至各器皿内。8.3.6在每只器皿中央部位的细胞层上各轻轻放置一个试验样品，应确保样品覆盖细胞层表面约十分之
操作时应注意防止样品不必耍的移动，否则可能会导致细胞的物理性损伤，这可从被移动细胞的碎片来判断。
注：如可能，在细胞加入前将样品放入培养器皿内。
8.3.7同法制备阴性和阳性对照材料平行器皿。8.3.8器皿按8.3.3中所述同样条件进行培养，培养期间（最少24h）应符合选定方法的要求。8.3.9去除上层培养基，接8.5确定细胞毒性反应。8.4间接接触试验8.4.1琼脂扩散试验8.4.1.1该试验用于细胞毒性定性评价，该方法不适用于不能通过琼脂层扩散的可沥滤物或与琼脂反应的物质。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999
8.4.1.2从持续搅样的细跑悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入每只试验用平行器皿内。轻轻水平转动器
皿．使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。
8.4.1.3根据培养基选择含或不含5%（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进
行培养，直至对数生长期末细胞近汇合。
8.4.1.4试验前用显微检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.4.1.5弃去器皿中的培养基，然后将溶化琼脂与含血清的新鲜培养基混合，使琼脂最终质量浓度为
0.5%～2%，每只器皿内加入等量的该混合液。只能使用适合于哺乳动物细胞生长的琼脂。该混合琼脂培
养基应为液态，温度应适合于哺乳动物细胞。
注：各种不同分子量和纯度的琼脂可通用。
8.4.1.6将试验样品轻轻放在每只器血的固化琼脂层上，样品应覆盖细胞层表面约十分之一。
吸水性材料置于琼脂之前先用培养基进行湿化处理，以防止琼脂脱水。
8.4.1.7同法制备阴性对照和阳性对照样品器皿。
8.4.1.8按8.4.1.3中所述的同样条件培养24h~72h.
8.4.1.9从琼脂上小心地取下样品之前、之后检测细胞毒性.。
用活体染色剂如中性红可有助于检测细胞毒性。活体染色剂可在培养前或培养后与样品一起加入．如
在培养前加，应在避光条件下进行细胞培养，以防因染色剂光活化作用而引起细胞损伤。
8.4.2滤膜扩散试验
8.4.2.1该试验用于细胞毒性定性评价。
8.4.2.2在数只试验用培养皿内，各放置一枚孔径0.45μm、无表面活性剂的滤膜，并加入等量持续搅拌
的细胞悬浮液，轻轻水平转动培养皿使细胞均匀地分散在每只滤膜的表面。
8.4.2.3根据培养基选择含或不含5%（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进
行培养，直至对数生长期末细胞近汇合。
8.4.2.4试捡前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。
8.4.2.5弃去培养皿内的培养基，将滤膜细胞面向下．放在固化的琼脂层上（见8.4.1.6）。
8.4.2.6轻经将试验样品放到滤膜无细胞面的上面．滤膜上放置不产生反应的环，用以保留提取液和新加
入的成分。
8.4.2.7同法制备阴性和阳性对照样品滤膜。
8.4.2.8按8.4.2.3所述方法培养2h±10min。
8.4.2.9轻轻从滤膜上取下样品，并从琼脂面上小心分离开滤膜。
8.4.2.10采用合适的染色程序确定细胞毒性反应。
8.5细胞毒性判定
8.5.1可来用定性或定量方法检测细胞毒性。
a）定性评价：用显微镜检查细胞（如果需耍，使用细胞化学染色）评价诸如一般形态、空泡形成、
脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化，一般形态的改变可描述性地在试验报告中记录或以数字记录，
以下是给试验材料计分的有效方法。
细胞需性计分
含义
0
无细胞毒性
1
轻微细胞毒性
2
中度细胞毒性
3
重度细胞毒性
试验报告中应包括评价方法和评价结果。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999
b）定量评价：测定细胞死亡、细胞生长抑制、细胞繁殖或细胞克隆形成。可以用客观的方法对细胞数量、蛋白总量、酶的释放、活体染料的释放和还原或其他可测定参数进行定量测试，使用的方法和测试结果应在试验报告中记录。
注：一些检测细胞毒性的特殊方法，可能需要零点或基线细胞培养对照。
8.5.2应慎重选择评价方法，试验样品如果释放对试验系统或对检测有影响的物质时，试验结果可能无效。
注：评价细胞活力，释放甲醛的材料须经过可靠的试验验证。
8.5.3各平行培养皿的检测结果如有显著差异，则判定试验不当或无效。8.5.4阴性、阳性及任何其他对照物（参照、培养基、空白、试剂等）在试验系统中如无预期的反应，则应重新检测。9试验报告
试验报告应详细包括以下所有内容：a）样品的描述；b）细胞系并对选择进行论证；c）培养基；d）评价方法和原理；c）浸提步骤（如必要），如可能报告沥出物质的性质和浓度；f）阴性、阳性和其他对照物；g）细胞反应和其他情况；h）结果评价所需的其他有关资料。10结果评价应由合格的专业人员根据试验数据对试验结果进行总体评价。结果如没有说服力或者无效，应重做试验。
————————————————————
篇十六：聚合物的阳性对照材料
P> GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999医疗器械生物学评价第5部分:体外细胞毒性试验
1范围GB/T16886的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵育；a）用器械的浸提液，和／或b)与器械接触。这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应.
2规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T16886的本部分的引用而成为本部分的条款.凡是注日期的引用文件，
其随后所有的修改单(不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T16886。1医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验(GB/T16886。1-2001，idtISO109931:1997）
CB/T16886.12—2000医疗器械生物学评价第12部分：样品制备和参照材料(idtISO1099312：1996)
3术语与定义GB/T16886.1/ISO1993-1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。
3。1阴性对照材料negativecontrolmaterial
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。
注：阴性对照的目的是验证背景反应，例如高密度聚乙烯1）已作为合成聚合物的阴性对照材料，氧化陶瓷棒则用作牙科材料的阴性对照物。
3.2阳性对照材料positivecontrolmaterial按照本部分试验时可重现细胞毒性反应的材料。
注：阳性对照的白目的是验证相应试验系统的反应,例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯2）已用作固体材料和浸提液的阳性对照，酚的稀释液用于浸提液的阳性对照.
_____________________________________1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会(Rockvillie，Maryland，USA)和Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729—5，Hanagawa。257-Japan)获得.提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。2)有机锡聚氯乙烯阳性对照材料可从SIMSPortexLtd,Hythe，Kent，CT216JL，UK(产品号码499—300—000)获得。ZDEC和ZDBC聚氨甲酸乙酯可从Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729—5，Hanagawa257—Japan）获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保.
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：19993。3
试剂对照reagentcontrol在不加试验材料的条件下，按浸提条件和试验步骤得到的浸提介质.
注:在本部分中，该定义取代GB/T16886.12/lSO10993—12中3.1给出的定义。
3。4培养器皿culturevessels适用于细胞培养的器皿,包插玻璃培养皿、塑料培养瓶或塑料多孔培养板和微量滴定板等器皿。
注，在这些试验方法中,这些器皿只要符合组织培养级别的要求,并适用于哺乳动物细胞培养．可以互换使用。
3.5近汇合subconfluency在对数生长期末，约80%的细胞汇合。
4样品制备4.1总则
供试品可选用：a）材料浸提液；和／或B）材料本身。样品制备应符合CB/T16886.12/ISO10993—12.4。2材料浸提液的制备4。2.1浸提原则为了测定潜在的毒理学危害，浸提条件应模拟或严于临床使用条件，但不应导致试验材料发生，诸如熔化、溶解或化学结构改变等明显变化。
注：浸提液中任何内源性或外源性物质的浓度及其接触试验细胞的量取决于接触面积、浸提体积、pH、化学溶解度、扩散率、溶质度、搅拌、温度、时间和其他因素.
4。2。2浸提介质
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999哺乳动物细胞检测中应使用下列一种或几种溶剂。对浸提介质的选择应进行验证：a）含血清培养基;b）无血清培养基；c)生理盐水溶液；d)其他适宜的溶剂.
注：溶剂的选择应反映出浸提的目的,并应考虑使用极性和非极性两种溶剂。适宜的溶剂包括纯水、植物油、二甲基亚砜（DMSO)。在所选择的测试系统中．如DMSO浓度大于0.5％（体积分数），则有细胞毒性.
4.2.3浸提条件4。2.3.1浸提应使用无菌技术,在无菌、化学惰性的封闭容器中进行,应符合GB/T16886。12/lSO10993-12的基本要求。4.2。3。2推荐的浸提条件是:
a）37℃±2℃下不少于24h;b）50℃±2℃下72h±2h;c）70℃±2℃下24h±2h；d）121℃±2℃下1h士0。2h。可根据器械特性和具体使用情况选择推荐的条件。当浸提过程使用含血清培养基时,只能来用4。2.3.2a）规定的浸提条件.4。2。3。3浸提液用于细胞之前，如果进行过滤、离心或其他处置方法,最终报告（见第9章）中应予以说明，对浸提液pH值的调整也应在提告中说明。对浸提撞的处理，例如对pH值的调整会影响试验结果。4.3直接接触试验材料的制备4。3。1在细胞毒性检测中,多种形状、尺寸或物理状态（即液态或固态)的材料未经修整即可进行测试。固体样品应至少有一个平面。其他形状和物理状态的样品应进行调整。4。3。2应考虑试验样品的无菌性。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：19994。3。2。1无菌器械试验材料的试验全过程应按无菌操作法进行。4。3。2.2试验材料如取自通常在使用前灭菌的器械，应按照制造商提供的方法灭菌，并且试验全过程应按无菌操作法进行。
用于试验系统之前,制备试验材料时应考虑灭菌方法或灭菌剂对器械的影响。4.3.2。3试撞材料如取自使用中不需要灭菌的器械,则应在供应状态下使用，但在试验全过程中应按无菌操作法进行。4。3.3对液体进行试验应：
a）直接附着；或b)附着到具有生物惰性和吸收性的基质上.
注:滤膜是适用的基质。
4。3.4对高吸收性材料，如果可能，试验前应用培养基将其浸透,以防吸收试验器皿中的培养基。
5细胞系5.1优先采用已建立的细胞系并应从认可的贮源获取3）5。2在需要特殊敏感性时，只能使用直接由活体组织获取的原代细胞、细胞系和器官型培养物，但需证明其反应的重现性和准确性。5。3细胞系原种培养贮存时，应放在相应培养基内，在—80℃或—80℃以下冻存，培养基内加有细胞保护剂，如二甲基亚砜或甘油等,长期贮存（几月至几年）只能在—130℃或-130℃以下冻存.5.4试验应使用无支原体污染细胞,使用前采用可靠方法检测是否存在支原体污染.
6培养基6。1培养基应无菌。6。2含血清或无血清培养基应符合选定细胞系的生长要求。
注：培养基中允许含有对试验无不利影响的抗生素.
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999培养基的稳定性与其成分和贮存条件有关。含谷氨酰胺和血清的培养基在2℃～8℃条件下贮存不超
过一周,含谷氨酰胺的无血清培养基在2℃~8℃条件下贮存不超过2周。6.3培养基的pH值应为7.2～7。4。7细胞原种培养制备
7.1用选定的细胞系和培养基制备试验所需足够的细胞。使用冻存细胞时,如加有细胞保护剂应除去,使用前至少传代培养一次。
7。2取出细胞，用适宜的酶分散法和／或机械分散法制备成细胞悬浮液。————--——-——-———
3)推荐的细胞系如CCL1（NCTCclone929)，CCL163（Balb/3T3cloneA31）、CCL171（MRC—5)、CCL75（Wl—38）、CCL81（Vero）、CCL10[BHK—21（C—l3)和V—79379A。这一信息只是为本部分的使用者提供方便,但ISO对使用该产品不提供担保。也可使用其他能得出相同或更佳结果的细胞系。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：19998试验步骤8。1平行样数
至少采用三个平行试验样品数和对照数。8.2浸提液试验8。2.1该试验用于细胞毒性定性和定量评价。8。2。2从持续搅拌的细胞悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入浸提液接触的每只培养器皿内，轻轻转动培养器皿使细胞均匀地分散在器皿的表面。8。2.3根据培养基选择含或不含5%(体帜分数)二氧化碳的空气作为缓冲系统,在37℃士2℃温度下进行培养。
试验应在近汇合单层细胞或新鲜悬浮细胞上进行。如仅是检测克隆形成，应采用较低的细胞密度。8。2。4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8。2。5试验可选用:a）浸提原液；和b）以培养基作稀释剂的系列浸提稀释液。试验如果用单层细胞，应弃去培养器皿中的培养基，在每只器皿内加等量浸提液或上述稀释液。如用悬浮细胞进行试验，细胞悬浮液制备好后立即将浸提液或上述稀稀释液加到每只平行器皿中。8。2。6采用水等非生理浸提液时,浸提液用培养基稀稀后应在最高生理相容浓度下试验.
注：建议在稀释浸提液时使用浓缩的(如2倍、5倍)培养基。
8.2.7加等量的空白试剂和阴性及阳性对照液至其他平行器血中。
注：如需要，还可以用新新鲜培养基做对照试验.
8.2.8器皿按8.2。3中所述同样条件进行培养，培养期间应符合选定方法的要求.8。2.9经过至少24h的培养后，接8.5确定细胞毒性反应。8。3直接接触试验8。3.1该试验用于细胞毒性定性和定量评价。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：19998。3。2从持续搅拌的细胞悬液中吸取等量的悬浮液,注入与试验样品直接接触的每只器皿内。轻轻水平转动器皿，使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。
8。3。3根据培养基选择含或不含5％（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养,直至培养细胞生长至近汇合。8.3.4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.3.5弃去培养器皿中的培养基，加新鲜培养基至各器皿内.8。3.6在每只器皿中央部位的细胞层上各轻轻放置一个试验样品,应确保样品覆盖细胞层表面约十分之
操作时应注意防止样品不必耍的移动,否则可能会导致细胞的物理性损伤，这可从被移动细胞的碎片来判断。
注：如可能，在细胞加入前将样品放入培养器皿内。
8.3。7同法制备阴性和阳性对照材料平行器皿。8。3。8器皿按8.3。3中所述同样条件进行培养，培养期间（最少24h）应符合选定方法的要求。8.3。9去除上层培养基，接8.5确定细胞毒性反应。8。4间接接触试验
8.4。1琼脂扩散试验
8。4。1.1该试验用于细胞毒性定性评价，该方法不适用于不能通过琼脂层扩散的可沥滤物或与琼脂反应的物质。8。4。1.2从持续搅样的细跑悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入每只试验用平行器皿内。轻轻水平转动器皿．使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。
8.4。1。3根据培养基选择含或不含5％（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养，直至对数生长期末细胞近汇合。
8。4。1.4试验前用显微检查培养细胞的近汇合和形态情况。8.4.1。5弃去器皿中的培养基，然后将溶化琼脂与含血清的新鲜培养基混合，使琼脂最终质量浓度为0.5%~2％，每只器皿内加入等量的该混合液。只能使用适合于哺乳动物细胞生长的琼脂。该混合琼脂培养基应为液态，温度应适合于哺乳动物细胞。
注：各种不同分子量和纯度的琼脂可通用.
8。4。1。6将试验样品轻轻放在每只器血的固化琼脂层上,样品应覆盖细胞层表面约十分之一。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999
吸水性材料置于琼脂之前先用培养基进行湿化处理，以防止琼脂脱水.
8。4.1。7同法制备阴性对照和阳性对照样品器皿.
8.4.1。8按8。4。1.3中所述的同样条件培养24h~72h。
8.4。1.9从琼脂上小心地取下样品之前、之后检测细胞毒性。。
用活体染色剂如中性红可有助于检测细胞毒性。活体染色剂可在培养前或培养后与样品一起加入．如在培养前加，应在避光条件下进行细胞培养,以防因染色剂光活化作用而引起细胞损伤.
8.4.2滤膜扩散试验
8。4.2.1该试验用于细胞毒性定性评价.
8。4。2。2在数只试验用培养皿内，各放置一枚孔径0.45μm、无表面活性剂的滤膜，并加入等量持续搅拌的细胞悬浮液，轻轻水平转动培养皿使细胞均匀地分散在每只滤膜的表面。
8.4.2.3根据培养基选择含或不含5%（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养,直至对数生长期末细胞近汇合。
8.4。2。4试捡前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。
8.4。2。5弃去培养皿内的培养基，将滤膜细胞面向下．放在固化的琼脂层上(见8.4。1。6）.
8。4。2.6轻经将试验样品放到滤膜无细胞面的上面．滤膜上放置不产生反应的环,用以保留提取液和新加入的成分。
8。4.2。7同法制备阴性和阳性对照样品滤膜。
8。4.2.8按8.4。2.3所述方法培养2h±10min。
8.4。2。9轻轻从滤膜上取下样品，并从琼脂面上小心分离开滤膜.
8。4.2。10采用合适的染色程序确定细胞毒性反应。
8.5细胞毒性判定
8。5。1可来用定性或定量方法检测细胞毒性。
a）定性评价：用显微镜检查细胞（如果需耍，使用细胞化学染色)评价诸如一般形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化，一般形态的改变可描述性地在试验报告中记录或以数字记录,以下是给试验材料计分的有效方法。
细胞需性计分
含义
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：1999
0
无细胞毒性
1
轻微细胞毒性
2
中度细胞毒性
3
重度细胞毒性
试验报告中应包括评价方法和评价结果.
b)定量评价：测定细胞死亡、细胞生长抑制、细胞繁殖或细胞克隆形成。可以用客观的方法对细胞数量、蛋白总量、酶的释放、活体染料的释放和还原或其他可测定参数进行定量测试，使用的方法和测试结果应在试验报告中记录.
注：一些检测细胞毒性的特殊方法，可能需要零点或基线细胞培养对照.
8。5.2应慎重选择评价方法，试验样品如果释放对试验系统或对检测有影响的物质时，试验结果可能无效.
注:评价细胞活力，释放甲醛的材料须经过可靠的试验验证。
8。5。3各平行培养皿的检测结果如有显著差异，则判定试验不当或无效。
8.5。4阴性、阳性及任何其他对照物（参照、培养基、空白、试剂等）在试验系统中如无预期的反应，则应重新检测.
9试验报告
试验报告应详细包括以下所有内容：
a）样品的描述；
b）细胞系并对选择进行论证；
c)培养基；
d)评价方法和原理；
c）浸提步骤(如必要）,如可能报告沥出物质的性质和浓度；
f)阴性、阳性和其他对照物；
g）细胞反应和其他情况；
h）结果评价所需的其他有关资料。
GB/T16886.5-2003/ISO10993-5：199910结果评价
应由合格的专业人员根据试验数据对试验结果进行总体评价。结果如没有说服力或者无效，应重做试验.
-—-—————-———-—--—-——
篇十七：聚合物的阳性对照材料
P> 医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验1范围GB/T16886的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵育；a）用器械的浸提液，和／或b）与器械接触。
￥
这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应。
2规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T16886的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，
其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验（GB/T,idtISO10993-1:1997）CB/T16886.12-2000医疗器械生物学评价第12部分：样品制备和参照材料（idtISO1099312:1996）
3术语与定义GB/T16886.1/ISO1993-1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。
|
阴性对照材料negativecontrolmaterial按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。
注：阴性对照的目的是验证背景反应，例如高密度聚乙烯1）已作为合成聚合物的阴性对照材料，氧化陶瓷棒则用作牙科材料的阴性对照物。
阳性对照材料positivecontrolmaterial按照本部分试验时可重现细胞毒性反应的材料。
注：阳性对照的白目的是验证相应试验系统的反应，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯2）已用作固体材料和浸提液的阳性对照，酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。
_____________________________________1)|2)高密度聚乙烯可从美国药典委员会（Rockvillie,Maryland,USA）和Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5,）获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。3)有机锡聚氯乙烯阳性对照材料可从SIMSPortexLtd,Hythe,Kent,CT216JL,UK（产品号码499-300-000）获得。ZDEC和ZDBC聚氨甲酸乙酯可从Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5,Hanagawa257-Japan)获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。
4)
试剂对照reagentcontrol在不加试验材料的条件下，按浸提条件和试验步骤得到的浸提介质。
注：在本部分中，该定义取代GB/T16886.12/lSO10993-12中给出的定义。
培养器皿culturevessels适用于细胞培养的器皿，包插玻璃培养皿、塑料培养瓶或塑料多孔培养板和微量滴定板等器皿。
·
注，在这些试验方法中，这些器皿只要符合组织培养级别的要求，并适用于哺乳动物细胞培养．可以互换使用。
近汇合subconfluency在对数生长期末，约80%的细胞汇合。
4样品制备总则供试品可选用：a）材料浸提液；和／或B）材料本身。
*
样品制备应符合CB/T16886.12/ISO10993-12。材料浸提液的制备浸提原则
为了测定潜在的毒理学危害，浸提条件应模拟或严于临床使用条件，但不应导致试验材料发生，诸如熔化、溶解或化学结构改变等明显变化。
注：浸提液中任何内源性或外源性物质的浓度及其接触试验细胞的量取决于接触面积、浸提体积、pH、化学溶解度、扩散率、溶质度、搅拌、温度、时间和其他因素。
浸提介质哺乳动物细胞检测中应使用下列一种或几种溶剂。对浸提介质的选择应进行验证：a)含血清培养基；b)无血清培养基；c)生理盐水溶液；
。
d)其他适宜的溶剂。
注：溶剂的选择应反映出浸提的目的，并应考虑使用极性和非极性两种溶剂。适宜的溶剂包括纯水、植物油、二甲基亚砜（DMSO）。在所选择的测试系统中．如DMSO浓度大于%（体积分数），则有细胞毒性。
浸提条件浸提应使用无菌技术，在无菌、化学惰性的封闭容器中进行，应符合GB/T16886.12/lSO10993-12的基本要求。推荐的浸提条件是：
a)37℃±2℃下不少于24h；b)50℃±2℃下72h±2h；c)70℃±2℃下24h±2h；d)121℃±2℃下1h士0.2h。
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可根据器械特性和具体使用情况选择推荐的条件。当浸提过程使用含血清培养基时，只能来用4.2.3.2a）规定的浸提条件。
浸提液用于细胞之前，如果进行过滤、离心或其他处置方法，最终报告（见第9章）中应予以说明，对浸提液pH值的调整也应在提告中说明。对浸提撞的处理，例如对pH值的调整会影响试验结果。
直接接触试验材料的制备在细胞毒性检测中，多种形状、尺寸或物理状态（即液态或固态）的材料未经修整即可进行测试。固体
样品应至少有一个平面。其他形状和物理状态的样品应进行调整。应考虑试验样品的无菌性。无菌器械试验材料的试验全过程应按无菌操作法进行。试验材料如取自通常在使用前灭菌的器械，应按照制造商提供的方法灭菌，并且试验全过程应按无菌操作法进行。用于试验系统之前，制备试验材料时应考虑灭菌方法或灭菌剂对器械的影响。
$
试撞材料如取自使用中不需要灭菌的器械，则应在供应状态下使用，但在试验全过程中应按无菌操作法进行。
对液体进行试验应：a）直接附着；或b）附着到具有生物惰性和吸收性的基质上。
注：滤膜是适用的基质。
对高吸收性材料，如果可能，试验前应用培养基将其浸透，以防吸收试验器皿中的培养基。
5细胞系优先采用已建立的细胞系并应从认可的贮源获取3）在需要特殊敏感性时，只能使用直接由活体组织获取的原代细胞、细胞系和器官型培养物，但需证
。
明其反应的重现性和准确性。
细胞系原种培养贮存时，应放在相应培养基内，在-80℃或-80℃以下冻存，培养基内加有细胞保护剂，如二甲基亚砜或甘油等，长期贮存（几月至几年）只能在-130℃或-130℃以下冻存。
试验应使用无支原体污染细胞，使用前采用可靠方法检测是否存在支原体污染。
6培养基培养基应无菌。含血清或无血清培养基应符合选定细胞系的生长要求。注：培养基中允许含有对试验无不利影响的抗生素。培养基的稳定性与其成分和贮存条件有关。含谷氨酰胺和血清的培养基在2℃～8℃条件下贮存不超
过一周，含谷氨酰胺的无血清培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过2周。培养基的pH值应为7.2～7.4。
7细胞原种培养制备用选定的细胞系和培养基制备试验所需足够的细胞。使用冻存细胞时，如加有细胞保护剂应除去，使用
前至少传代培养一次。取出细胞，用适宜的酶分散法和／或机械分散法制备成细胞悬浮液。
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3）推荐的细胞系如CCL1（NCTCclone929），CCL163（Balb/3T3cloneA31）、CCL171（MRC-5）、CCL75（Wl-38）、CCL81（Vero）、CCL10[BHK-21(C-l3)和V-79379A。这一信息只是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。也可使用其他能得出相同或更佳结果的细胞系。
8试验步骤平行样数至少采用三个平行试验样品数和对照数。浸提液试验
…
该试验用于细胞毒性定性和定量评价。从持续搅拌的细胞悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入浸提液接触的每只培养器皿内，轻轻转动培养器皿使细胞均匀地分散在器皿的表面。根据培养基选择含或不含5%（体帜分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃士2℃温度下进行培养。
试验应在近汇合单层细胞或新鲜悬浮细胞上进行。如仅是检测克隆形成，应采用较低的细胞密度。试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。试验可选用：a)浸提原液；和b)以培养基作稀释剂的系列浸提稀释液。试验如果用单层细胞，应弃去培养器皿中的培养基，在每只器皿内加等量浸提液或上述稀释液。
。
如用悬浮细胞进行试验，细胞悬浮液制备好后立即将浸提液或上述稀稀释液加到每只平行器皿中。采用水等非生理浸提液时，浸提液用培养基稀稀后应在最高生理相容浓度下试验。
注：建议在稀释浸提液时使用浓缩的（如2倍、5倍）培养基。
加等量的空白试剂和阴性及阳性对照液至其他平行器血中。
注：如需要，还可以用新新鲜培养基做对照试验。
器皿按8.中所述同样条件进行培养，培养期间应符合选定方法的要求。
经过至少24h的培养后，接8.5确定细胞毒性反应。直接接触试验该试验用于细胞毒性定性和定量评价。从持续搅拌的细胞悬液中吸取等量的悬浮液，注入与试验样品直接接触的每只器皿内。轻轻水平转动器皿，使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。
|
根据培养基选择含或不含5%（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养，直至培养细胞生长至近汇合。
试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。弃去培养器皿中的培养基，加新鲜培养基至各器皿内。在每只器皿中央部位的细胞层上各轻轻放置一个试验样品，应确保样品覆盖细胞层表面约十分之
操作时应注意防止样品不必耍的移动，否则可能会导致细胞的物理性损伤，这可从被移动细胞的碎片来判断。
注：如可能，在细胞加入前将样品放入培养器皿内。
同法制备阴性和阳性对照材料平行器皿。器皿按中所述同样条件进行培养，培养期间（最少24h）应符合选定方法的要求。去除上层培养基，接确定细胞毒性反应。间接接触试验
…
琼脂扩散试验该试验用于细胞毒性定性评价，该方法不适用于不能通过琼脂层扩散的可沥滤物或与琼脂反应的物质。从持续搅样的细跑悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入每只试验用平行器皿内。轻轻水平转动器皿．使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。根据培养基选择含或不含5%（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养，直至对数生长期末细胞近汇合。试验前用显微检查培养细胞的近汇合和形态情况。
弃去器皿中的培养基，然后将溶化琼脂与含血清的新鲜培养基混合，使琼脂最终质量浓度为%～2%，每只器皿内加入等量的该混合液。只能使用适合于哺乳动物细胞生长的琼脂。该混合琼脂培养基应为液态，温度应适合于哺乳动物细胞。
注：各种不同分子量和纯度的琼脂可通用。
将试验样品轻轻放在每只器血的固化琼脂层上，样品应覆盖细胞层表面约十分之一。吸水性材料置于琼脂之前先用培养基进行湿化处理，以防止琼脂脱水。
同法制备阴性对照和阳性对照样品器皿。
￥
按中所述的同样条件培养24h~72h.从琼脂上小心地取下样品之前、之后检测细胞毒性.。
用活体染色剂如中性红可有助于检测细胞毒性。活体染色剂可在培养前或培养后与样品一起加入．如在培养前加，应在避光条件下进行细胞培养，以防因染色剂光活化作用而引起细胞损伤。
滤膜扩散试验该试验用于细胞毒性定性评价。在数只试验用培养皿内，各放置一枚孔径μm、无表面活性剂的滤膜，并加入等量持续搅拌的细胞悬浮液，轻轻水平转动培养皿使细胞均匀地分散在每只滤膜的表面。根据培养基选择含或不含5%（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养，直至对数生长期末细胞近汇合。试捡前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。弃去培养皿内的培养基，将滤膜细胞面向下．放在固化的琼脂层上（见）。轻经将试验样品放到滤膜无细胞面的上面．滤膜上放置不产生反应的环，用以保留提取液和新加入的成分。
&
同法制备阴性和阳性对照样品滤膜。按所述方法培养2h±10min。轻轻从滤膜上取下样品，并从琼脂面上小心分离开滤膜。
采用合适的染色程序确定细胞毒性反应。
细胞毒性判定
可来用定性或定量方法检测细胞毒性。
a）定性评价：用显微镜检查细胞（如果需耍，使用细胞化学染色）评价诸如一般形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化，一般形态的改变可描述性地在试验报告中记录或以数字记录，以下是给试验材料计分的有效方法。
细胞需性计分
含义
0
无细胞毒性
1
轻微细胞毒性
{
2
中度细胞毒性
3
重度细胞毒性
试验报告中应包括评价方法和评价结果。
b）定量评价：测定细胞死亡、细胞生长抑制、细胞繁殖或细胞克隆形成。可以用客观的方法对细胞数量、蛋白总量、酶的释放、活体染料的释放和还原或其他可测定参数进行定量测试，使用的方法和测试结果应在试验报告中记录。
注：一些检测细胞毒性的特殊方法，可能需要零点或基线细胞培养对照。
应慎重选择评价方法，试验样品如果释放对试验系统或对检测有影响的物质时，试验结果可能无效。
注：评价细胞活力，释放甲醛的材料须经过可靠的试验验证。
各平行培养皿的检测结果如有显著差异，则判定试验不当或无效。
阴性、阳性及任何其他对照物（参照、培养基、空白、试剂等）在试验系统中如无预期的反应，则应重新检测。
9试验报告试验报告应详细包括以下所有内容：
a）样品的描述；b）细胞系并对选择进行论证；
c）培养基；d）评价方法和原理；c）浸提步骤（如必要），如可能报告沥出物质的性质和浓度；f）阴性、阳性和其他对照物；g）细胞反应和其他情况；h）结果评价所需的其他有关资料。10结果评价应由合格的专业人员根据试验数据对试验结果进行总体评价。结果如没有说服力或者无效，应重做试验。
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